海洋酸化和銅離子脅迫對海月水母碟狀幼體的影響

王 雷,彭賽君,董志軍

1 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗站, 煙臺 264003 2 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049 3 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)中心,青島 266071

海洋酸化是繼“溫室效應(yīng)”之后又一因CO2過量排放而引起的全球性環(huán)境問題[1]。工業(yè)革命以來,海洋吸收了大約1/3的人類排放CO2量,已造成海水pH下降0.1[2]。國外研究者預(yù)計2100年表層海水pH將下降0.3—0.4個單位[3],至2300年可能下降0.77[4]。近年來我國近岸海域季節(jié)性海水酸化問題嚴(yán)重,2011年秋季黃海海域底層pH降至7.79—7.90,渤海海域則僅為7.64—7.68[5]。海洋酸化導(dǎo)致海水化學(xué)環(huán)境改變,會影響海洋生物的基因表達(dá)、能量代謝和細(xì)胞應(yīng)激等生理活動,進(jìn)而影響海洋生物發(fā)育、繁殖、生物鈣化等生命過程[6- 13]。同時,工業(yè)廢水、城市污水及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的含Cu2+肥料和殺蟲劑等通江河徑流匯入近海,導(dǎo)致一些沿海地區(qū)海水銅含量超標(biāo)[14- 16]。銅作為分布最廣泛的環(huán)境污染物,近岸海域Cu2+濃度受陸源輸入和人為污染源影響而變化非常大,在我國遼東灣北部海域Cu2+最高濃度可達(dá)25.55 μg/L[17],錦州灣海域海水Cu2+含量為0.73—13.2 μg/L[18],而渤海灣海域則在0.38—2755 μg/L之間[19]。銅也是生命體一種必需微量元素,與生物體內(nèi)30多種酶氧化還原催化酶和分子氧載體功能的有關(guān)[20]。但高濃度Cu2+可造成水生動物抗氧化系統(tǒng)損傷、組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化和遺傳毒性作用,引起海洋生物嚴(yán)重的組織損傷甚至死亡[21- 23]。

海洋酸化可能改變重金屬在水環(huán)境的形態(tài),促進(jìn)Cu2+等金屬離子從沉積物或巖石中遷移至海水中,從而提高Cu2+在海水環(huán)境的濃度水平和水生生物體的生物利用率[24- 25]。Richards等[26]通過模型預(yù)測2100年海洋pH值(7.845)條件下,平均Cu2+濃度將增加115%。海洋酸化還會通過改變pH敏感金屬的生物效應(yīng)和潛在毒性間接影響海洋生物種群,有研究發(fā)現(xiàn),銅污染結(jié)合海洋酸化、低氧和升溫等應(yīng)激源將導(dǎo)致?？蜕汉鞯群Ｑ笊锔鼑?yán)重的氧化應(yīng)激效應(yīng),抑制生物體金屬離子酶活性,降低海洋生物對環(huán)境脅迫的耐受性[27-28]。Marques等[29]研究發(fā)現(xiàn),Cu2+和海水酸化造成有孔蟲Amphisteginagibbosa的Ca2+-ATP酶活性受到嚴(yán)重抑制,生長速率顯著降低,白化率更高。

水母作為海洋中一類重要的膠質(zhì)性浮游動物,在碳、氮、磷等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演重要角色,并在維持海洋生態(tài)系統(tǒng)能量流動和物質(zhì)循環(huán)過程中起到重要作用[30]。海月水母(Aureliacoeruleavon Lendenfeld,1884)是我國近海常見大型水母之一,其暴發(fā)給人類社會活動和海洋生態(tài)系統(tǒng)帶來許多負(fù)面影響[31- 33]。海月水母具有典型的世代交替現(xiàn)象[34],包括無性繁殖的營底棲生活的螅狀幼體階段和有性繁殖的營浮游生活的水母體階段。國內(nèi)外研究者進(jìn)行了大量研究探索溫度、鹽度、pH、重金屬等環(huán)境因素對海月水母生活史早期階段的影響,以預(yù)測未來海洋環(huán)境變化下海月水母種群變動趨勢[35- 43]。

海月水母碟狀幼體為浮游階段水母體的幼體形態(tài),每只螅狀幼體在橫裂期間可產(chǎn)生多達(dá)20—30個碟狀幼體[44]。缽水母是海洋毒理學(xué)研究最多的刺胞動物之一,常用指標(biāo)例如出芽繁殖、橫裂繁殖、碟狀幼體形態(tài)和收縮頻率等[45]。海月水母具有多種無性繁殖方式,繁殖速度較快,可以通過橫裂繁殖獲得體型和發(fā)育階段一致的碟狀幼體；碟狀幼體的生長速度較快,生長率、收縮頻率等易受到環(huán)境因素的影響。因此,海月水母也被認(rèn)為是環(huán)境毒理學(xué)研究的潛在模式生物和海洋環(huán)境污染監(jiān)測的重要指示物種[45- 47]。

過去10年間,研究者開展了海洋酸化對不同水母的影響研究,如：Kikkawa等[48]發(fā)現(xiàn),海月水母Aureliasp.碟狀幼體在pH 6.896海水中暴露96 h后發(fā)育畸形,pH 6.366時停止發(fā)育。Winans等[47]研究則表明,海洋酸化條件(pH 7.5和7.3)對海月水母(Aurelialabiata)螅狀幼體和碟狀幼體的生存或無性繁殖沒有顯著影響,但酸化海水會抑制碟狀幼體平衡石發(fā)育。與其他刺胞動物相比,代謝率較高的立方水母更容易受到海洋酸化影響[49]。Boco等[50]發(fā)現(xiàn)2300pCO2(即pH 7.5)海洋酸化條件對立方水母目Carybdeaxaymacana水母階段具有嚴(yán)重毒性影響,暴露于酸化海水12 h后C.xaymacana死亡率顯著增加。但海洋酸化與重金屬兩種環(huán)境壓力對水母脅迫效應(yīng)的研究仍處于空白。碟狀幼體作為海月水母生長階段初期,主要棲息于近岸河口區(qū)域,其生長發(fā)育易受到環(huán)境脅迫影響,了解海月水母碟狀幼體在海洋酸化和Cu2+脅迫下的生理變化,可以更有效預(yù)測未來海月水母種群變動。本研究設(shè)置兩個pH水平(pH 8.1和pH 7.6)和3個Cu2+濃度水平(0、10 μg/L和25 μg/L),通過測定抗氧化酶過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶Ca2+-ATP酶活性、呼吸率、收縮頻率和傘部直徑等生理指標(biāo),分析海月水母碟狀幼體在海洋酸化和Cu2+脅迫下的生理響應(yīng)。這些結(jié)果旨在了解海洋酸化和Cu2+對海月水母碟狀幼體生理代謝和生長發(fā)育等過程的差異影響,有助于預(yù)測未來環(huán)境條件下生物多樣性和其他生態(tài)進(jìn)程的變化趨勢。本研究結(jié)果將為評估全球和區(qū)域海洋環(huán)境問題對海洋生物的影響以及海洋環(huán)境監(jiān)測提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 海月水母碟狀幼體收集

海月水母成體2019年9月采集于煙臺市養(yǎng)馬島附近海域(37°26′43″N, 121°34′25″E),運(yùn)回牟平海岸帶環(huán)境綜合試驗站的水母養(yǎng)殖實驗室收集海月水母浮浪幼蟲。浮浪幼蟲發(fā)育為螅狀幼體后,喂食孵化鹵蟲(Artemiafranciscana)1日齡幼蟲。螅狀幼體生長至16觸手后,將培養(yǎng)溫度從15℃降至10℃刺激螅狀幼體橫裂[51]。螅狀幼體在10℃下4—5周后停止喂食,開始進(jìn)行橫裂。為獲得大致相同發(fā)育階段的碟狀幼體,前12 d釋放的碟狀幼體不用于實驗,僅選擇個體健康、形狀良好、大小一致的1日齡碟狀幼體進(jìn)行實驗。

1.2 實驗設(shè)置

海水酸化水平參照政府間氣候變化專門委員會(IPCC)模型預(yù)測RCP 8.5情景下2100年海水pH值(7.6),通過氣體流量控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)空氣-CO2混合氣體的比例和進(jìn)氣量,實現(xiàn)海水酸化條件[52]。Cu2+濃度參照中華人民共和國海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(二類海水Cu2+≤ 10 μg/L)以及渤海近岸海域環(huán)境相關(guān)濃度(遼東灣北部海水Cu2+最高值25.5 μg/L)設(shè)定,通過添加CuCl2溶液實現(xiàn)海水的Cu2+暴露濃度。

暴露實驗包括兩個pH水平(pH 8.1和pH 7.6)和3個銅暴露濃度(0、10 μg/L和25 μg/L)共6個處理組,每個處理設(shè)置3個300 L水族箱進(jìn)行實驗海水預(yù)處理。每個水族箱通過水泵連接10 L的U型水母缸,實驗海水以40 mL/min流速通過水母缸,保證水母缸25 min左右更新一次海水。每個水母缸碟狀幼體實驗數(shù)目為100只。實驗海水經(jīng)過沙缸過濾和紫外線殺菌處理,溫度控制在22℃。暴露實驗共進(jìn)行16 d,期間每天向水母缸中定時投餌鹵蟲1日齡無節(jié)幼體10 mL(50只/mL)。

每天使用NBS標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)的pH電極監(jiān)測實驗水體pH,使用YSI儀測定溫度、鹽度和溶解氧(DO)。每周從水族箱中收集水樣,使用自動電位滴定儀測定水體總堿度(TA)。根據(jù)TA值和測量參數(shù)(溫度、鹽度和pH值),利用CO2SYS軟件計算海水碳酸鹽化學(xué)的其他相關(guān)參數(shù)[53]。每周更換一次海水,更換海水后將pH和Cu2+濃度調(diào)節(jié)為設(shè)置條件。實驗結(jié)束時測定海月水母的呼吸率、收縮頻率和傘徑,液氮保存組織樣本進(jìn)行酶活測定。

1.3 抗氧化酶和離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性

采用南京建成生物工程研究所試劑盒,分別對保存樣品的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和Ca2+-ATP酶的活力水平進(jìn)行檢測,同時采用考馬斯亮藍(lán)法測定勻漿液的蛋白質(zhì)濃度。

稱量0.2 g左右的海月水母組織(n=6),按照勻漿稀釋5倍的比例加入一定量的勻漿介質(zhì)(0.9%生理鹽水),低溫勻漿后離心10 min(2500 rpm,4℃),收集上清液分裝待測。CAT、SOD和Ca2+-ATP酶活力的測定參照相關(guān)說明書進(jìn)行,組織總蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。酶活性測定單位為U/mg蛋白,其中1 U代表單位質(zhì)量蛋白在單位時間內(nèi)吸光度的變化；蛋白濃度的測定單位為mg/mL組織勻漿。

1.4 呼吸率

根據(jù)Pettersen等(2017)的方法[54],在暴露實驗結(jié)束后采用SensorDish Reader PreSens連接24通道微孔板測定海月水母碟狀幼體的呼吸率,測定前使用空氣飽和水和2%亞硫酸鈉緩沖液校準(zhǔn)傳感器。測定時每個水母缸隨機(jī)選擇10只海月水母,每只單獨放入含0.2 μm膜過濾海水的12孔板中,記錄2 h的氧含量變化值。為消除生物環(huán)境應(yīng)激效應(yīng)等影響,測定期前1小時數(shù)據(jù)舍棄。呼吸率的測定在恒溫培養(yǎng)箱22℃黑暗中進(jìn)行,測定結(jié)果為微孔板中氧含量變化值MO。利用如下公式計算呼吸率(Respiration rates)：

Respiration rates=(MjO-McO)/WW

式中,MjO為水母測定孔氧含量變化值,McO為背景空白孔氧含量變化值,WW為測定水母濕重。

1.5 收縮頻率

根據(jù)Alguero-Muniz等(2016)的方法[43],在暴露實驗結(jié)束后對每個處理組的海月水母收縮頻率進(jìn)行測定。每個水母缸隨機(jī)選擇10只海月水母碟狀幼體放置在12孔板中,使用體視顯微鏡連接電腦軟件OPT Pro攝像3 min,記錄每只海月水母的收縮次數(shù)(p)。利用如下公式計算收縮率(Pulsation rates)：

Pulsation rates=p/(t1-t0)

式中,p為t0至t1時間內(nèi)的收縮次數(shù)。

1.6 傘部直徑

根據(jù)Heins等(2018)的方法[55],在暴露實驗開始前和結(jié)束時使用體視顯微鏡連接電腦拍攝軟件OPT Pro,拍照測量碟狀幼體的傘部直徑。每個水母缸隨機(jī)取10只實驗個體,放置在含2 mm高度海水的培養(yǎng)皿中進(jìn)行拍照測量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析(ANOVA),檢驗不同處理間均值的顯著性,顯著性水平定義為P<0.05；使用單因素方差分析分別對正常pH水平和酸化pH水平下不同濃度Cu2+處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析；使用Tukey(方差齊性)檢驗,比較相同Cu2+濃度處理下,正常pH海水組和酸化海水組的差異。實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。

2 結(jié)果

本實驗通過充入CO2氣體模擬海洋酸化環(huán)境,通過添加CuCl2溶液模擬近海銅污染環(huán)境。表1總結(jié)了海月水母暴露實驗海水溫度、鹽度、pH以及其他碳酸鹽化學(xué)參數(shù)。酸化海水處理的pH條件控制在預(yù)期海水酸化水平附近(±0.02)。實驗過程中,海水溫度均保持在22℃左右,鹽度在31左右。

表1 海月水母暴露期間相關(guān)海水化學(xué)參數(shù)

2.1 抗氧化酶和離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶酶活性

在海水酸化和Cu2+暴露16 d后,海月水母碟狀幼體的CAT活性隨著海水pH降低和Cu2+濃度增加呈現(xiàn)降低趨勢。在0 μg/L Cu2+條件下,酸化海水組和正常海水組CAT活性差異極顯著,但加入Cu2+后酸化對CAT活性影響不顯著。在兩個pH水平下,10 μg/L和25 μg/L Cu2+處理組的CAT活性顯著低于0 μg/L Cu2+處理組。根據(jù)表2,海水酸化和Cu2+暴露對CAT活性具有極顯著交互作用(P<0.01)(圖1)。

暴露16 d后,海月水母碟狀幼體的SOD活性隨Cu2+濃度升高呈現(xiàn)顯著增加趨勢(P<0.01),酸化對SOD活性影響不顯著。在兩個pH水平下,25 μg/L Cu2+處理組的SOD活性顯著高于0 μg/L和10 μg/L Cu2+處理組,但0 和10 μg/L 兩個Cu2+處理組之間的差異性不顯著(圖2)。

圖1 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的CAT活性 Fig.1 CAT activities of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposureCAT：過氧化氫酶Catalase; 不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)；星號(*)表示相同濃度的Cu2+處理下,正常pH與酸化pH之間存在差異(**P<0.01)

圖2 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的SOD活性 Fig.2 SOD activities of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposureSOD：超氧化物歧化酶Superoxide dismutase; 不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)

隨著pH降低和Cu2+濃度增加,海月水母Ca2+-ATP酶活性呈現(xiàn)顯著降低的趨勢。0和10 μg/L Cu2+條件下,酸化對Ca2+-ATP酶活性具有顯著抑制作用。在兩個pH水平下,10 μg/L和25 μg/L Cu2+處理組的Ca2+-ATP酶活性較0 μg/L Cu2+處理組顯著降低。根據(jù)表2,海洋酸化和Cu2+暴露對Ca2+-ATP酶具有顯著的交互作用(P<0.05)(圖3)。

表2 雙因素方差分析：海水酸化和Cu2+脅迫對海月水母碟狀幼體的影響

2.2 呼吸率

海水酸化和Cu2+暴露對海月水母碟狀幼體呼吸率具有顯著影響(P<0.01)。當(dāng)Cu2+濃度為0 μg/L時,酸化海水組呼吸率較正常pH海水組顯著升高,但在10 μg/L和25 μg/L Cu2+時,正常pH海水組呼吸率明顯高于酸化海水組。在正常pH海水中,海月水母的呼吸率隨Cu2+濃度增加呈現(xiàn)顯著增加趨勢,但酸化海水組的呼吸率隨Cu2+濃度增加先升高后降低。根據(jù)雙因素方差分析,海水酸化和Cu2+對海月水母的呼吸率均具有顯著的促進(jìn)作用,兩者存在顯著的交互作用(P<0.01)(圖4)。

圖3 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的Ca2+-ATP酶活性 Fig.3 Ca2+-ATPase activities of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)；星號(*)表示相同濃度的Cu2+處理下,正常pH與酸化pH之間存在差異(**P<0.01)

圖4 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的呼吸率 Fig.4 Respiration rates of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)；星號(*)表示相同濃度的Cu2+處理下,正常pH與酸化pH之間存在差異(*P<0.05,**P<0.01)

2.3 收縮頻率

海水酸化和Cu2+暴露對海月水母碟狀幼體收縮頻率的影響如圖5所示。暴露16 d后,在相同的Cu2+濃度處理下,酸化對海月水母收縮頻率沒有顯著性影響。隨著Cu2+暴露濃度的增加,海月水母收縮頻率均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢,25 μg/L Cu2+處理組的收縮率顯著低于0 和10 μg/L Cu2+處理組。Two-way ANOVA 分析表明,海水酸化和Cu2+對收縮頻率影響的交互作用不顯著(P>0.05)。

2.4 傘部直徑

圖6為不同海水pH和Cu2+濃度下的海月水母碟狀幼體傘部直徑。碟狀體初始傘徑為(3.51±0.2)mm,各處理組之間碟狀體初始傘徑不存在顯著性差異(P>0.05)。暴露16 d后,海月水母傘部直徑隨Cu2+濃度增加呈現(xiàn)顯著降低趨勢,25 μg/L Cu2+處理組的水母傘部直徑顯著小于0 μg/L Cu2+處理組。根據(jù)體視顯微鏡拍攝的暴露16 d后碟狀幼體圖像顯示(圖7),Cu2+嚴(yán)重影響碟狀幼體的生長,并導(dǎo)致發(fā)育畸形。不同Cu2+濃度下,酸化對海月水母生長的影響不一致,0 μg/L Cu2+濃度時,正常pH海水組的水母傘徑顯著大于酸化海水組；但加入 Cu2+后,正常pH海水組的水母傘徑明顯小于酸化海水組。海水酸化和銅暴露對海月水母碟狀幼體的生長均具有顯著影響(P<0.01),兩者存在顯著拮抗作用(P<0.01)。

3 討論

本研究首次探究了海月水母碟狀幼體對海洋酸化和Cu2+兩種環(huán)境脅迫因子的生理響應(yīng),從抗氧化酶和離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性、呼吸、運(yùn)動以及生長等方面探究兩種脅迫因子在不同濃度下對海月水母的綜合影響。研究結(jié)果表明,海月水母對兩種環(huán)境脅迫因子敏感性不同,單獨Cu2+暴露比單獨酸化暴露的脅迫效應(yīng)更嚴(yán)重,這與Siddiqui等[28]在海洋酸化和Cu2+對珊瑚生理影響的研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)海水酸化與Cu2+對海月水母呼吸率和生長具有拮抗作用,海水酸化可緩解Cu2+對海月水母碟狀幼體的毒性影響。Lewis等[56]也報道了類似現(xiàn)象,海膽Paracentrotuslividus體內(nèi)的酸堿調(diào)節(jié)機(jī)制可在酸化條件下(pH 7.7)增加細(xì)胞外碳酸氫鹽水平,保護(hù)性地對抗Cu2+毒性,減輕Cu2+暴露引起的DNA損傷。Larsen等[57]在對大西洋鱈魚(Gadusmorhua)研究中也提出酸化對Cu2+毒性的保護(hù)作用,游離Cu2+將與HCO32-形成一系列絡(luò)合物,升高的碳酸氫鹽水平可以降低海水游離Cu2+的比例,從而減少銅毒性對生物造成的損害。

圖5 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的收縮頻率 Fig.5 Pulsation rates of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)

圖6 海水酸化和Cu2+暴露下海月水母的傘部直徑 Fig.6 Bell diameter of A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure不同字母表示相同的pH處理下,不同濃度的Cu2+處理之間存在顯著性(P<0.05)；星號(*)表示相同濃度的Cu2+處理下,正常pH與酸化pH之間存在差異(**P<0.01)

圖7 海水酸化和Cu2+暴露下的海月水母碟狀幼體Fig.7 A. coerulea ephyrae after elevated pCO2 and/or Cu2+ exposure在0 μg/L(a)、10 μg/L(b)和25 μg/L(c)Cu2+濃度下,正常pH海水組的碟狀幼體；0 μg/L(d)、10 μg/L(e)和25 μg/L(f)Cu2+濃度下,酸化pH海水組的碟狀幼體。比例尺：2 mm

3.1 海洋酸化和Cu2+對海月水母抗氧化酶和離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶的影響

本研究表明,海洋酸化和Cu2+脅迫對海月水母抗氧化酶CAT和SOD以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶Ca2+-ATP酶活性具有顯著影響。CAT活性隨著Cu2+濃度的增加而降低,SOD活性隨著Cu2+濃度增加而增加,表明Cu2+可能引起海月水母較強(qiáng)的氧化應(yīng)激效應(yīng),但會抑制CAT的活性。海水酸化對CAT活性也具有顯著抑制作用。任虹等[58]研究重金屬污染物對文蛤(Meretrixmeretrix)金屬酶類發(fā)現(xiàn),當(dāng)Cu2+濃度高于5 μmol/L時對CAT的抑制效果顯著。其他研究也發(fā)現(xiàn),櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)內(nèi)臟團(tuán)組織的CAT活性隨著Cu2+濃度增加,表現(xiàn)出“抑制-誘導(dǎo)-抑制”的規(guī)律,但整體表現(xiàn)為降低趨勢,重金屬對CAT的抑制作用可能由于Cu2+干擾酶分子鐵卟啉環(huán)中Fe2+的結(jié)合而抑制其活性[59]。Siddiqui等[28]研究表明,隨著pCO2增加,?？鸈xaiptasiapallida的CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性顯著降低。

Ca2+-ATP酶是Ca2+激活的Mg2+依賴性ATP酶,負(fù)責(zé)生物體鈣的主動轉(zhuǎn)運(yùn)和維持細(xì)胞pH穩(wěn)定[60]。Ca2+-ATP酶作為一種離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,也被認(rèn)為是易受到環(huán)境干擾的敏感生物標(biāo)志物[29]。許多重金屬對珊瑚、貽貝和海膽等鈣化生物的ATP酶活性具有抑制作用,通過氧化應(yīng)激條件誘導(dǎo)膜損傷,重金屬離子可以導(dǎo)致膜結(jié)合的ATP酶活性受損[61-62]。有研究表明,暴露于含Cu2+海水的珊瑚以及在高Cu2+濃度海域采集的有孔蟲的Ca2+-ATP酶活性較低[23]。本研究結(jié)果也顯示,海洋酸化和Cu2+均對Ca2+-ATP酶活性具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)。以往研究發(fā)現(xiàn),低pH條件下水螅幼體橫裂釋放出的碟狀幼體平衡石明顯較小[47]。海水酸化或重金屬條件下,海月水母的Ca2+-ATP酶活性降低,可能影響水母體內(nèi)鈣的吸收和平衡石等鈣質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成。作為水母感受器官感覺棍的重要組成部分,平衡石的損傷或缺失將導(dǎo)致水母生長畸形和游泳行為不規(guī)律[47]。

3.2 海洋酸化和Cu2+對海月水母呼吸率的影響

呼吸率是海洋生物代謝活動的直接指標(biāo),浮游動物的呼吸率主要受環(huán)境溫度和生物體重影響,還受生物的活力水平、環(huán)境深度和O2分壓及物種特異性行為的影響[54,63-65]。本研究表明,正常pH海水條件下,海月水母呼吸率隨Cu2+濃度的升高呈現(xiàn)顯著升高趨勢；而在酸化海水中,呼吸率隨Cu2+濃度先升高后降低。結(jié)果表明銅暴露造成海月水母機(jī)體代謝水平升高,但酸化可能減緩Cu2+對水母體的毒性應(yīng)激效應(yīng)。Catarino等[65]研究表明,低溫及低pH(7.7和7.4)暴露導(dǎo)致海膽Paracentrotuslividus呼吸率顯著升高。也有研究發(fā)現(xiàn),在Cu2+暴露環(huán)境中,草魚(Ctenopharyngodonidella)幼魚有氧代謝增加37.48%,同時草魚幼魚的游泳能力也受到影響,游泳效率降低[66]。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時,生物體可能需要通過離子調(diào)節(jié)等生理過程以適應(yīng)環(huán)境變化,而生物消耗體內(nèi)儲存能量應(yīng)對環(huán)境變化的生存策略,可能是導(dǎo)致機(jī)體代謝率升高的原因之一。

3.3 海洋酸化和Cu2+對海月水母收縮頻率的影響

收縮行為是海月水母碟狀幼體的主要運(yùn)動方式,碟狀幼體通過收縮緣葉進(jìn)行游動,捕獲獵物和躲避天敵等[48]。本研究表明,海月水母的收縮頻率隨著銅暴露濃度的增加逐漸降低,正常pH海水、25 μg/L Cu2+暴露處理海月水母的收縮頻率最低。Tills等[46]研究發(fā)現(xiàn),在pH 7.6酸化條件下暴露7天后,海月水母(A.aurita)碟狀幼體收縮率顯著降低,收縮周期更長。但本研究中,在0 μg/L Cu2+條件下,正常pH海水組海月水母收縮頻率顯著小于酸化海水處理組。可能原因是水母受到海水阻力隨著傘部直徑增加而增大,導(dǎo)致水母收縮頻率降低。海月水母碟狀幼體不同生長階段收縮頻率的變化,需要進(jìn)一步研究。在10 μg/L和20 μg/L Cu2+濃度下,酸化海水組碟狀幼體的收縮頻率高于正常pH海水組,這可能表明海水酸化可以緩解Cu2+對海月水母碟狀幼體收縮率的影響。之前的研究表明,水母對海洋酸化具有較高的耐受性,長期海洋酸化模擬實驗發(fā)現(xiàn)pH值對海月水母無致命毒性影響[67]。Kikkawa等[48]研究發(fā)現(xiàn),海月水母(Aurelia. sp)碟狀幼體在暴露于5,000 matmpCO2酸化條件時收縮頻率才出現(xiàn)降低趨勢。

3.4 海洋酸化和Cu2+對海月水母生長的影響

本研究表明,海水酸化和Cu2+暴露對碟狀幼體的生長具有顯著抑制作用。暴露16 d后,正常pH海水和0 μg/L Cu2+的海月水母生長狀況最好,該處理組中海月水母的平均傘徑最大。當(dāng)pH降低或加入Cu2+后,所有處理的海月水母生長發(fā)育均顯示出負(fù)面影響,高濃度的Cu2+還會導(dǎo)致海月水母嚴(yán)重畸形。有研究表明,水體中過量的Cu2+會對魚類的鰓片造成損傷,引起鰓片上皮細(xì)胞腫脹、變形和嚴(yán)重增生,最終導(dǎo)致魚類缺氧死亡[68],其他研究也報道了有孔蟲和貝類等生物Cu2+暴露后出現(xiàn)脂質(zhì)囊泡增殖和組織損傷等細(xì)胞學(xué)異?，F(xiàn)象[69-71]。有研究表明短期暴露于酸化海水或鋅、鎘等重金屬污染物會極大地影響水母毒素的生物活性,造成水母毒素的溶血性降低[70]。此外,Morabito等[72]還發(fā)現(xiàn)重金屬或海水酸化暴露下,夜光游水母(Pelagianoctiluca)離體刺細(xì)胞的離子通道和共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低,極大影響水母刺絲囊反應(yīng)；低pH條件下細(xì)胞膜水滲透性降低,刺細(xì)胞釋放過程延長甚至失去釋放能力。含有毒素的刺細(xì)胞對于刺胞動物的捕食和生存至關(guān)重要,刺細(xì)胞損傷將影響水母的捕食行為,最終影響其能量攝入以及生長發(fā)育。

工業(yè)革命以來,人類活動造成的海洋環(huán)境變化速度正在加劇,這導(dǎo)致了水母暴發(fā)、赤潮、滸苔暴發(fā)等海洋生物災(zāi)害事件頻繁發(fā)生,給人類生產(chǎn)生活和海洋生態(tài)系統(tǒng)多樣性造成嚴(yán)重威脅。因此,利用生物評估模型預(yù)測海洋生物在未來海洋環(huán)境下的生理代謝變化和種群趨勢具有重要意義。作為新興的環(huán)境監(jiān)測方法,生物評估模型中的生物化學(xué)(例如免疫應(yīng)激有關(guān)的酶)和生理(例如生長率和收縮頻率)變化等生物標(biāo)記物可以比物理和化學(xué)監(jiān)測手段更為直觀地反映海洋生物受到環(huán)境污染的影響。

4 結(jié)論

海水酸化和Cu2+暴露共同影響海月水母生活史早期階段碟狀幼體的生理代謝和生長發(fā)育。在實驗設(shè)置水平下,海水酸化和Cu2+對海月水母碟狀幼體CAT、Ca2+-ATP酶活性具有抑制作用,造成SOD活性升高,引起免疫應(yīng)激效應(yīng)；呼吸率則表現(xiàn)出Cu2+促進(jìn)效應(yīng),海洋酸化和Cu2+暴露下水母需要將更多的能量用于抵御逆境,但海洋酸化和Cu2+表現(xiàn)為拮抗效應(yīng),酸化可以緩解Cu2+對呼吸率的刺激作用；在Cu2+暴露下,海月水母的收縮頻率顯著降低,這可能導(dǎo)致海月水母捕食能力下降；海月水母碟狀幼體的生長也受到海水酸化和Cu2+的抑制,傘徑長度隨pH降低和Cu2+濃度增加而減小。