酚酸物質(zhì)對紅松種子萌發(fā)及苗木生長和生理特性的影響

梁薇薇,陳立新,段文標(biāo),李亦菲,李少然,于穎穎

東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,哈爾濱 150040

在森林生態(tài)系統(tǒng)中,酚酸類物質(zhì)可作為植物參與競爭的直接或間接手段[1],為其提供競爭優(yōu)勢。酚酸類物質(zhì)是目前公認(rèn)的化感物質(zhì)[2-3],可由植物揮發(fā)、淋溶、滲出和殘渣的分解釋放到環(huán)境中[4],通過許多潛在機(jī)制,如對植物根系的導(dǎo)水性和養(yǎng)分吸收的影響,導(dǎo)致礦物成分的變化[5],從而抑制植物生長,或者通過對植物光合作用、可溶性物質(zhì)和抗氧化酶產(chǎn)生影響而導(dǎo)致植物生長受到抑制[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)[8-9],松樹林內(nèi)凋落物浸提液對松樹種子萌發(fā)及幼苗生長有不同程度影響,其受凋落物浸提液濃度影響顯著。

紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)廣泛分布于亞洲東部,是我國東北地區(qū)典型地帶性頂極植被類型(針闊混交林)主要優(yōu)勢種和建群種。通過在涼水國家級自然保護(hù)區(qū)闊葉紅松林內(nèi)調(diào)查、觀測及前期研究中發(fā)現(xiàn),紅松生長和更新受到不同程度地抑制。前期試驗通過高效液相色譜法(HPLC)在闊葉紅松林凋落物(椴樹、紅松、楓樺)及土壤中鑒定出13種酚酸類物質(zhì),其中苯甲酸、丁香酸、香草酸含量較高,因此,本試驗假設(shè)這3種酚酸物質(zhì)可作為化感物質(zhì)影響紅松生長更新。為驗證所提假設(shè),本試驗通過室內(nèi)模擬試驗進(jìn)行紅松種子萌發(fā)和苗木盆栽試驗,分析不同濃度3種酚酸溶液對紅松種子發(fā)芽指標(biāo)及紅松苗生長指標(biāo)和生理特性的影響,為探索闊葉紅松林內(nèi)化感作用機(jī)理及解決紅松更新障礙問題提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年4月4日,于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實驗林場取回低溫窖藏并催芽的紅松種子及3年生紅松苗。其中,紅松種子千粒重700 g,紅松苗株高(22.0±3.8)cm,地徑(5.1±0.8)mm。苯甲酸(BA：benzoic acid)、丁香酸(SA：syringic acid)和香草酸(VA：vanillic acid)購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 種子發(fā)芽試驗

紅松種子在蒸餾水中浸泡催芽6 h后,用10%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒10 min,用無菌蒸餾水漂洗數(shù)次,然后用無菌去離子水沖洗3次后陰干。培養(yǎng)皿(直徑9 cm)及紗布于高壓滅菌鍋中高溫高壓滅菌20 min,將兩層滅菌紗布鋪在潔凈培養(yǎng)皿內(nèi),每培養(yǎng)皿中放入均勻飽滿受體紅松種子15粒。設(shè)苯甲酸、丁香酸、香草酸各3個濃度處理組(2、20、200 mg/L),試驗中所設(shè)3個濃度處理均以前期試驗測定凋落物及土壤中實際酚酸物質(zhì)濃度為參考選取,以蒸餾水為對照(CK),每組重復(fù)3次,每培養(yǎng)皿內(nèi)分別注入溶液15 mL(處理液添加量基于種子周圍沒有水膜)。培養(yǎng)皿用滅菌紗布覆蓋,在(25±0.5)℃ 恒溫箱(1/1000過氧乙酸消毒)中培養(yǎng),每天滴入2 mL相應(yīng)溶液對紗布進(jìn)行濕潤以保持其濕度。種子置床后第一粒種子萌發(fā)時間作為種子發(fā)芽起始時間,種子萌發(fā)標(biāo)志以胚根突破種皮1 mm為標(biāo)準(zhǔn),于每天中午記錄發(fā)芽數(shù),連續(xù)3 d沒有種子萌發(fā)為止,計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)。將發(fā)芽種子每天補充2 ml處理液,直至種子脫殼,利用毫米刻度尺測量種子胚軸長、胚根長。

1.3 苗木生長試驗

蛭石與珍珠巖(高溫高壓滅菌20 min)1:1混合裝入200 × 250 mm塑料盆中(至盆高3/4處),將3年生紅松苗移栽到盆中緩苗15 d。試驗前,記錄每株紅松苗株高及地徑(距地面1 cm處)位置,盆栽試驗于實驗室(平均溫度25 ℃,平均日長12 h)自然光下進(jìn)行,用2、20、200 mg/L苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液進(jìn)行澆灌,對照(CK)澆灌等量蒸餾水,每處理重復(fù)5盆,每10 d澆灌250 mL相應(yīng)溶液及5 mL Hoagland營養(yǎng)液,并將托盤中流出液倒回盆內(nèi),以確保各處理組土壤中酚酸含量與試驗設(shè)計一致。在紅松苗生長期間,根據(jù)基質(zhì)濕度補充蒸餾水以防止水分脅迫,直到試驗結(jié)束。2018年10月15日結(jié)束試驗,將紅松苗整株收獲,進(jìn)行生長指標(biāo)(株高、地徑、生物量)、光合色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)、抗氧化酶活性(過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT、超氧化物歧化酶SOD)、膜脂過氧化指標(biāo)(丙二醛MDA)及可溶性滲透物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白)含量測定。

1.4 測定方法

種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)按以下公式計算：發(fā)芽勢(%)=前4 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%[10]；發(fā)芽率(%)=試驗期間種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%[11]；發(fā)芽指數(shù)= ∑Gt/Tt[12],式中,Gt為第t天發(fā)芽種子數(shù),Tt為發(fā)芽天數(shù)。光合色素含量采用分光光度法測定[13]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定,過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定[14]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[15]；可溶性糖含量采用硫酸-蒽酮顯色法測定[16]；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定[17]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用軟件SPSS 19. 0對紅松種子發(fā)芽指標(biāo)、紅松苗生長指標(biāo)及生理特性指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)及多重比較(Duncan’s test),用Sigmaplot 12.5進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度苯甲酸、丁香酸和香草酸溶液對紅松種子萌發(fā)的影響

不同濃度3種酚酸溶液均抑制紅松種子萌發(fā),其發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)均顯著低于CK(P<0.05)。酚酸溶液濃度變化對紅松種子發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)影響差異均不顯著,對發(fā)芽率影響差異顯著(P<0.05),其中,20 mg/L BA、VA溶液和200 mg/L SA溶液對紅松種子發(fā)芽抑制效果強于其他濃度處理組,發(fā)芽率僅為64.45%、57.78%和53.33%(表1)。

不同濃度3種酚酸對紅松種子胚軸長及胚根長影響差異不顯著。紅松種子胚根受3種酚酸溶液影響強于胚軸,其中,BA濃度2 mg/L、20 mg/L時促進(jìn)胚根生長,200 mg/L時抑制胚根生長,不同濃度SA溶液均促進(jìn)胚根生長,而VA溶液對胚根影響表現(xiàn)為低濃度抑制,高濃度促進(jìn)(圖1)。

表1 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

圖1 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松種子胚軸長、胚根長的影響Fig.1 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on hypocotyl length and radicle length of Pinus koraiensis seeds不同小寫字母表示同種酚酸不同濃度間差異顯著(P < 0.05)；CK：對照組 control；BA：苯甲酸 benzoic acid；SA：丁香酸 syringic acid；VA：香草酸 vanillic acid

2.2 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗生長指標(biāo)的影響

各處理組株高、地徑、生物量增加量均低于CK,表明不同濃度BA、SA和VA溶液對紅松苗生長(株高、地徑)及物質(zhì)積累(生物量)具有抑制作用。酚酸濃度變化對紅松苗株高和地徑影響差異均不顯著,但對生物量、根干重和莖干重影響差異均顯著(P<0.05)。其中,VA溶液對紅松苗株高抑制作用強于其他處理組,SA溶液對地徑抑制作用強于其他處理組。200 mg/L BA溶液對紅松苗生物量增加抑制作用強于其他處理組。20 mg/L BA溶液抑制紅松苗地上部分生長,而促進(jìn)地下部分物質(zhì)積累。BA溶液各處理組根莖比均高于CK。2 mg/L、20 mg/L SA溶液和VA溶液處理組根莖比低于CK,200 mg/L處理組高于對照(表2)。

2.3 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗針葉光合色素含量的影響

BA、SA和VA溶液處理紅松苗對其針葉葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素均有一定影響。其中,不同濃度BA溶液處理紅松苗后,針葉葉綠素a含量均低于CK,且含量差異顯著(P<0.05)。SA溶液對針葉葉綠素a含量影響為中、低濃度抑制,高濃度促進(jìn),而VA溶液作用與之相反。不同濃度BA溶液處理紅松苗后,其針葉葉綠素b含量均低于CK且含量差異不顯著。20 mg/L SA溶液抑制針葉葉綠素b產(chǎn)生,其他濃度處理組針葉葉綠素b含量與CK差異均不顯著；中濃度 VA溶液對針葉葉綠素b抑制作用強于其他濃度。不同濃度BA溶液處理組針葉類胡蘿卜素含量均低于CK,且濃度變化對其含量影響差異顯著(P<0.05)。SA溶液對針葉類胡蘿卜素含量影響為中、低濃度抑制,高濃度促進(jìn),而VA溶液為中、低濃度促進(jìn),而高濃度抑制。20 mg/L SA溶液對葉綠素a、葉綠素b影響強于其他處理組,其含量僅為CK的56.47%、62.07%。20 mg/L BA、SA和VA均對類胡蘿卜素影響強于其他處理組,其含量分別為CK的57.14%、61.90%、57.14%(表3)。

表3 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗光合色素的影響

2.4 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗針葉抗氧化酶系統(tǒng)及膜脂過氧化的影響

不同濃度BA和VA溶液對紅松苗針葉POD活性影響顯著(P<0.05),不同濃度SA溶液對POD活性影響不顯著。BA溶液隨濃度升高對POD活性抑制作用減弱,而SA溶液隨濃度升高對POD活性抑制作用增強。不同濃度3種酚酸溶液對CAT活性影響整體與對POD活性影響一致。3種酚酸溶液對SOD活性影響除200 mg/L BA溶液抑制其活性外,其余各處理組均增加SOD活性,其中BA各濃度處理組針葉SOD 活性顯著高于CK,2 mg/L BA溶液對SOD活性促進(jìn)作用強于其余處理組,且高于CK組SOD活性13.6%(圖2)。

圖2 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the antioxidant enzyme activity of Pinus koraiensis seedlings不同小寫字母表示同種酚酸不同濃度間差異顯著(P < 0.05)；下同；POD：過氧化物酶 peroxidase；CAT：過氧化氫酶 catalase；SOD：超氧化物歧化酶 superoxide dismutase

圖3 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗MDA含量的影響 Fig.3 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the MDA content of Pinus koraiensis seedlingsMDA：丙二醛 malondialdehyde

不同濃度BA、SA和VA溶液均顯著增加紅松苗針葉MDA 含量,MDA含量隨BA溶液濃度增加表現(xiàn)為先增加后降低,20 mg/L BA溶液對針葉MDA合成的促進(jìn)作用強于2 mg/L和200 mg/L。MDA含量隨SA和VA溶液濃度增加而增加,200 mg/L SA對MDA合成的促進(jìn)作用高于其他處理組,且高于CK組MDA含量70.51%(圖3)。

2.5 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗針葉滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

不同濃度VA溶液、SA和VA混合溶液對紅松苗針葉可溶性糖及可溶性蛋白含量影響顯著(圖4)。針葉可溶性糖含量隨BA溶液濃度升高而逐漸增加,而可溶性蛋白含量為CK>200 mg/L>2 mg/L>20 mg/L。SA溶液處理紅松苗后,針葉可溶性糖含量為20 mg/L>2 mg/L>CK>200 mg/L,可溶性蛋白含量均高于CK。VA處理紅松苗后,針葉可溶性糖含量為20 mg/L>CK>2 mg/L>200 mg/L,可溶性蛋白含量為CK>2 mg/L>200 mg/L>20 mg/L。其中,200 mg/L BA對針葉可溶性糖含量產(chǎn)生的促進(jìn)作用顯著強于其他處理組,而200 mg/L VA溶液對針葉可溶性糖含量產(chǎn)生的抑制作用明顯強于其他處理組。

3 結(jié)論與討論

3.1 酚酸物質(zhì)影響種子萌發(fā)

酚酸類物質(zhì)對種子萌發(fā)的影響是通過復(fù)雜的生化過程介導(dǎo)實現(xiàn)的。已有大量研究表明,酚酸抑制種子發(fā)芽[18-21]。本實驗結(jié)果與前人研究一致,BA、SA、VA溶液均對種子萌發(fā)存在抑制作用,且對種子萌發(fā)的抑制作用強于對胚軸及胚根長的影響。向日葵(HelianthusannuusL.)葉片水提物通過抑制白芥(SinapisalbaL.)種子內(nèi)肽鏈內(nèi)切酶和異檸檬酸裂解酶活性,干擾種子內(nèi)部儲存蛋白質(zhì)和脂肪酸降解,進(jìn)而阻礙種子對O2的吸收,抑制ATP產(chǎn)生,從而干擾種子能量代謝,最終抑制種子萌發(fā)[22]。激素在種子萌發(fā)中發(fā)揮重要作用,不同激素協(xié)同或拮抗調(diào)控著植物生長發(fā)育[23-25]。Shu等[26]和Holdsworth等[27]研究表明,赤霉素促進(jìn)種子萌發(fā),而脫落酸抑制種子萌發(fā)。Muscolo等[28]研究了不同森林土壤中提取的低分子酚類物質(zhì)對落葉松(Pinuslaricio, Poiret, spp calabrica)種子萌發(fā)及其萌發(fā)過程中呼吸酶和磷酸戊糖氧化途徑酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)所有酚酸對落葉松萌發(fā)均有抑制作用,且種子萌發(fā)受抑制與糖酵解酶和氧化磷酸戊糖途徑酶的活性密切相關(guān)。由此可見,BA、SA、VA溶液對紅松種子萌發(fā)的影響可以通過抑制胚胎生長、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、干擾種子中活性氧的產(chǎn)生和積累、影響種子萌發(fā)過程中酶活性和代謝途徑、打破種子內(nèi)源激素平衡等多種途徑來實現(xiàn)。

圖4 不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗可溶性物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the soluble matter content of Pinus koraiensis seedlings

3.2 酚酸物質(zhì)影響幼苗生長及生理特性

已知化感物質(zhì)通過改變植物代謝過程而導(dǎo)致植物生長減緩[29-30]。其中,酚酸類物質(zhì)可影響植物體內(nèi)吲哚乙酸(IAA)濃度,調(diào)節(jié)參與IAA合成或分解的酶的活性,IAA通過改變細(xì)胞壁伸展性和通透性引起細(xì)胞分裂,因此,酚酸類物質(zhì)可以在完整植株莖伸長、細(xì)胞分裂及分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用,引起植物生物量積累的變化[16]。Bi等[31]研究9種酚類化合物對西洋參(PanaxquinquefoliusL.)幼苗根莖生長的抑制作用,其中水楊酸、肉桂酸、香豆酸、香草酸、丁香酸均能顯著抑制其幼苗根莖生長。本試驗中,不同濃度3種酚酸均可導(dǎo)致紅松苗生物量積累減少,其中,SA、VA溶液對紅松苗株高及地徑的抑制強于BA,BA溶液對地下部分物質(zhì)積累的抑制作用弱于其他處理組。同時,不同濃度酚酸溶液處理紅松苗使針葉葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量出現(xiàn)不同程度減少。葉片光合色素在植物光合作用中發(fā)揮極為重要的作用,其含量降低將導(dǎo)致光能吸收及傳遞受阻,最終引起光合速率下降[32]。Nimbal等[33]研究認(rèn)為,化感物質(zhì)能有效抑制光系統(tǒng)Ⅱ中電子受體QA和QB之間的電子傳遞,進(jìn)而影響光合作用。Baziramakenga等[6]研究結(jié)果表明,低濃度苯甲酸和肉桂酸可以增加大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)葉綠素含量,而高濃度則產(chǎn)生相反效果。葉綠素含量與植物生物量積累密切相關(guān)[34],葉片葉綠素含量降低會限制光合速率和光合產(chǎn)物的積累,從而降低植物的總生長量[22,35],因此,紅松苗針葉葉綠素含量減少是導(dǎo)致紅松苗生物量積累受抑制的原因之一。

不同濃度3種酚酸處理紅松苗后,其針葉中POD、CAT活性受到顯著抑制,SOD活性增加。SOD清除植物體內(nèi)超氧化物陰離子并產(chǎn)生 H2O2[36],POD和CAT將紅松苗體內(nèi)過多H2O2清除從而降低活性氧的毒害作用[37-38],但由于酚酸處理使紅松苗體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)酶活性發(fā)生改變致使其不能保持原有正常水平,從而破壞了活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡[39-41]?；钚陨叩腟OD將O2-轉(zhuǎn)化為 H2O2時,活性下降的POD、CAT無法清除大量累積的H2O2以確保紅松苗體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡,導(dǎo)致過量H2O2累積在紅松苗體內(nèi)加劇了膜脂過氧化,使膜結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞,引起一系列生理生化代謝紊亂,導(dǎo)致傷害發(fā)生,對紅松苗機(jī)體形成氧化損傷,作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的可溶性糖及可溶性蛋白含量升高正是3種酚酸對紅松苗機(jī)體氧化損傷結(jié)果的體現(xiàn)。MDA作為氧化傷害和脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物,具有很強的毒性,可抑制蛋白質(zhì)合成或?qū)е旅富钚詥适42]。因此,從MDA含量顯著增加也可看出不同濃度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液對紅松苗產(chǎn)生較大程度傷害,紅松苗因氧化損傷致使其生長受抑制,生長狀況變差。由此可知,苯甲酸、丁香酸、香草酸通過破壞紅松苗體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)而抑制紅松苗生長。

酚酸脅迫條件下,植物細(xì)胞會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如可溶性糖、可溶性蛋白等),以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透勢、維持水分平衡及細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)[43]?？扇苄蕴遣粌H作為細(xì)胞的代謝能源和結(jié)構(gòu)組成成分,還是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中的各種信號[44]。糖信號途徑與脅迫途徑相互作用,以調(diào)節(jié)植物的代謝反應(yīng)[45-46]。可溶性糖含量的波動是化感脅迫過程中常見的現(xiàn)象[47]。而由于蛋白質(zhì)相對合成速率減小,現(xiàn)有可溶性蛋白質(zhì)大量分解為游離氨基酸,用于調(diào)節(jié)滲透壓并提供代謝能源,從而造成可溶性蛋白含量降低[48-49]。本試驗中,不同濃度BA、SA、VA溶液對可溶性糖及可溶性蛋白含量影響顯著,其中,紅松苗為平衡3種濃度BA溶液及20 mg/L SA和VA溶液的化感脅迫作用而積累可溶性糖,使可溶性糖含量增加,而紅松苗為調(diào)節(jié)不同濃度 BA、VA溶液對其產(chǎn)生的化感作用,導(dǎo)致紅松苗針葉中可溶性蛋白含量減少。不同濃度酚酸溶液對紅松種子萌發(fā)及苗木生長的影響存在較大差異性,可能是由于紅松在不同生育時期對酚酸感應(yīng)程度不同造成。

本試驗證實了先前提出的假設(shè),即BA、SA、VA在闊葉紅松林生態(tài)系統(tǒng)中可能作為化感物質(zhì)影響紅松種子萌發(fā)及苗木生長。而在自然生態(tài)環(huán)境中,化感作用是化感物質(zhì)綜合作用的結(jié)果,因此,研究化感物質(zhì)間的化感綜合效應(yīng)及設(shè)計合理的野外實驗,對進(jìn)一步正確了解影響闊葉紅松林中的化感作用機(jī)理及解決紅松更新障礙問題具有更重要的意義。