lncRNA NEAT1通過靶向抑制miR-29a促進低氧低糖誘導的肺纖維化進程的機制研究

張 喜，段效軍，李林瑞，陳艷萍

0 引言

肺纖維化是一種常見的由慢性阻塞性肺疾病、嚴重感染、肺損傷、環(huán)境因素等引起的肺疾病[1]。缺氧缺血在許多生物學或者病理學過程中起著至關重要的作用[2]。當肺處于缺氧缺血狀態(tài)時，肺泡上皮細胞由于應激發(fā)生肺纖維化，最終可能造成癌變[3-4]。目前，臨床上還沒有專門用于預防缺血缺氧導致肺纖維化的藥物，治療策略也僅限于支持性治療。因此，從缺血缺氧引發(fā)的纖維化的一系列因子作用環(huán)節(jié)中尋找有效的治療靶點，為預防和改善缺血缺氧介導的肺纖維化具有重大意義。

lncRNA一般通過對miRNA的sponge作用調控目標蛋白，進而影響細胞的生物學改變[5]。近年來，lncRNA在纖維化中的作用受到廣泛關注，但在調控肺纖維化的研究報道較少，且主要集中于博來霉素誘導的肺纖維化[6]。在低氧誘導的肺纖維化發(fā)生過程中，lncRNAs是否也發(fā)揮重要的調控作用，還有待深入研究。NEAT1是新近被發(fā)現(xiàn)的位于亞核體結構“paraspeckles”周圍的lncRNA[7]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1可通過調控miR-122和KLF6加速肝纖維化的進程[8]。此外，lncRNA NEAT1可通過激活Akt/mTOR信號通路加速糖尿病腎病的增殖和纖維化[9]。研究者進行了與肺纖維化發(fā)病機制相關的研究，旨在確定治療靶點，但其分子機制仍不明確。因此，了解lncRNA NEAT1在低氧誘導的肺纖維化進展中的作用，可以為肺纖維化的治療提供新的靶點。

MicroRNAs (miRNAs)是一類以mRNA為靶點并調節(jié)翻譯抑制的大型非編碼RNA分子[10]。miRNAs參與許多生物學過程，如發(fā)育時間[11]、細胞增殖[12]、凋亡[13]、神經元模式[14]、造血和器官發(fā)育[15]等。近年研究顯示，miR-29家族在纖維化中起關鍵作用，miR-29a可通過抑制CD4+T細胞的分化阻止肝纖維化的進展[16-17]。然而，miR-29a在肺纖維化過程中的變化尚無報道。因此，系統(tǒng)、全面地描述lncRNA NEAT1和miR-29a之間的相互作用和調控模式，可以增強我們對肺纖維化發(fā)病機制的理解。

本研究旨在研究lncRNA NEAT1和miR-29a在低氧低糖誘導的肺纖維化中的表達以及l(fā)ncRNA NEAT1是否可以調控miR-29a的表達，從而影響低氧誘導的肺纖維化進程，并闡明其潛在的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 收集湖南省兒童醫(yī)院健康者和缺血再灌注引起急性肺損傷患者的血清樣本各20份。所有患者均簽署了知情同意書，所有實驗均獲得醫(yī)院倫理委員會的批準與監(jiān)督。每份血清樣本都保存在-80 ℃直至使用。

1.1.2 動物 40只8周齡C57/B6野生型小鼠由湖南省實驗動物中心提供。所有動物實驗均按照國家實驗動物管理法規(guī)和動物實驗倫理委員會規(guī)定進行。

1.1.3 細胞 人肺泡II型上皮細胞A549和HEK-293T細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.1.4 試劑 DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TRIzol試劑來自美國Invitrogen公司；SYBR Premix EX TaqTMI試劑盒購自日本TaKaRa公司；抗col1、col3a1、α-SMA和TGF-β抗體來自美國Cell Signaling Technologies公司；多聚甲醛、HE染料和Masson染料購自北京Solarbio公司；裂解液等生化試劑購自上海羅氏公司；慢病毒介導的sh-NEAT1、anti-miR-29a以及陰性對照(NC)載體購自中國上海Genechem公司；羥脯氨酸試劑盒和CCK-8試劑盒購自南京建城生物工程研究所；雙熒光素酶報告試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)、模型構建及轉染 細胞的培養(yǎng)：A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，HEK-293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，都置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h全換液1次，保證細胞正常生長所需的營養(yǎng)，待細胞密度長至90%，使用0.25%胰酶消化按1∶3進行傳代。選取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

肺纖維化細胞模型的構建：將A549細胞置于RPMI 1640+10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，作為對照組，細胞置于無糖平衡鹽溶液(pH=7.4)培養(yǎng)，放入37 ℃、5%CO2、1%O2的缺氧培養(yǎng)箱內培養(yǎng)作為模型組。同時在模型組的細胞中轉染sh-NC和sh-NEAT1 病毒作為模型+sh-NC組和模型+sh-NEAT1組。

細胞轉染：將肺泡上皮細胞(A549)接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)18～24 h，待細胞密度至2×105/孔時，用含有6 μg/ml polybrene的新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，進行慢病毒轉染，37 ℃培養(yǎng)24 h后進行全換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 Hoechst染色 使用Hoechst染色試劑盒，按照制造商的說明書對A549細胞進行細胞凋亡檢測。取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5 min，用PBS洗滌3次，再用細胞培養(yǎng)液洗滌1次，將蓋玻片置于6孔板，接種細胞培養(yǎng)過夜。對細胞進行轉染處理后，吸盡培養(yǎng)液，加入Hoechst固定液0.5 ml，固定10 min，吸走固定液，用PBS洗2次，3 min/次，加入Hoechst染色液0.5 ml，孵育5 min，棄染色液，用PBS洗2次，3 min/次，滴1滴防淬滅封片劑于載玻片上，蓋上有細胞的蓋玻片。在熒光顯微鏡下進行分析。

1.2.3 Western blot 用RIPA裂解液裂解肺泡上皮細胞和肺組織，提取蛋白質并進行蛋白定量和煮樣。配置10%的SDS-PADE瓊脂糖凝膠進行電泳(80 V 20 min，100 V 1 h)，電泳結束后進行電轉(100 V 150 min)，再用5%的牛奶對膜進行室溫封閉1 h，用1×TBST洗3次，10 min/次，孵育一抗4 ℃過夜，次日用1×TBST洗3次膜，10 min/次，再室溫孵育二抗1 h，用1×TBST洗3次膜，10 min/次，進行顯影。最后使用Image J軟件對Western blot條帶進行定量，并進行歸一化。主要一抗有β-actin(抗兔)、col1(抗兔，1∶1 000)、col3a1(抗兔，1∶1 000)、α-SMA(抗兔，1∶1 000)和TGF-β(抗兔，1∶1 000)，二抗是山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000)。

1.2.4 實時定量PCR(qRT-PCR) 用TRIzol法提取細胞或組織的總RNA。細胞去除培養(yǎng)基，每皿直接加入1 ml TRIzol，反復吹打轉移至RNA-free的EP管，室溫靜置5 min，每管加入250 μl氯仿，室溫靜置3 min，14 000 g，4 ℃離心15 min。樣品分為3層，水相是在室溫下與500 μl異丙醇混合10 min。離心機在14 000 g，4 ℃ 離心10 min，取上層清液加入1 ml乙醇洗RNA，在10 000 g，4 ℃離心5 min，棄上清加入10 μl RNA-free水。用NanoDrop 8000測定提取的RNA的濃度和純度。再反轉為cDNA，使用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒進行RT-PCR檢測mRNA的相對表達水平。采用2-△△Ct法計算相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 缺血缺氧肺損傷動物模型的構建 動物隨機分為對照組、模型組、模型+sh-NC組、模型+sh-NEAT1組。實驗前大鼠禁食不禁水，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，靜脈留置導管，氣管插管，接動物呼吸機。模型組剪開頸部皮膚，經右頸靜脈注射肝素。平臥位經左五肋間進胸，暴露左肺門，以無損傷血管夾夾閉左肺門。對照組開胸后僅游離肺門，不做夾閉。臨時關閉胸腔，后開放血管夾并逐層關胸，再灌注6 h。模型組+sh-NC組和模型組+sh-NEAT1組的小鼠再經尾靜脈注射接受病毒sh-NC和sh-NEAT1溶液，病毒處理35 d后對老鼠進行安樂死，經肺循環(huán)灌流后肺組織變白，取組織用多聚甲醛固定進行HE和Masson染色病理學檢測纖維化程度差異。

1.2.6 HE染色及Masson染色 HE染色：將小鼠肺組織固定在4%多聚甲醛24 h。在石蠟包埋后，用冰凍切片機將肺組織切成4 μm，先用蒸餾水清洗1～2 s，蘇木精液染色(60 ℃)30～60 s，流水洗去蘇木精液，1%鹽酸乙醇 1～3 s，稍水洗，促藍液返藍5～10 s，流水沖洗15～30 s，0.5%曙紅液染色30～60 s，蒸餾水稍洗1～2 s，80%、95%和100%乙醇梯度酒精脫水，每步1～2 s，二甲苯浸泡3次，每次 2～3 s，最后用中性樹脂封片。

Masson染色：將小鼠肺組織固定在4%多聚甲醛24 h。在石蠟包埋后，用冰凍切片機將肺組織切成4 μm，先用蒸餾水清洗肺切片，再蘇木精液染核5～10 min，用蒸餾水洗，再用Masson 麗春紅酸性復紅液5～10 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，直接用苯胺藍或光綠液染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，再用80%、95%和100%酒精進行梯度脫色處理，二甲苯浸洗3次，10 min/次，最后使用中性樹膠封片。用Masson染色法評價膠原沉積。

1.2.7 羥脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)含量檢測 肺組織在1.5 ml 5%三氯乙酸中均質化。用蒸餾水洗去質粒，用2 ml的6N HCl在100 ℃水解過夜。用NaOH中和水解產物后，每個樣品加入1 ml 0.05 mol/L的氯胺-T溶液，然后在60 ℃下用1 ml 20%對二甲氨基苯甲醛顯色20 min。在550 nm處讀取吸光度。用純化的羥脯氨酸制備標準曲線。數(shù)據(jù)表示為μg羥脯氨酸/mg肺積水。

1.2.8 RIP 以狀態(tài)良好的HEK-293T細胞為實驗對象，穩(wěn)定過表達NEAT1，將甲醛加入細胞培養(yǎng)液，固定后迅速加入2.5 mol/L甘氨酸解交聯(lián)，PBS洗滌，刮下細胞，置于離心管中。于冰上將離心管超聲，超聲后細胞懸液變得澄清透明，離心后取上清液。上清液經稀釋后，分成兩部分，分別加入特異性抗體和對照IgG，于4 ℃旋轉過夜，第2天加入磁珠旋轉。分別用稀釋緩沖液、低鹽溶液、高鹽溶液、氯化鋰溶液以及TE緩沖液洗滌共7次。用洗脫緩沖液洗脫。將洗脫的產物上樣，qPCR檢測產物中miR-29a的表達情況。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因分析 利用Invitrogen法合成了含有野生型(WT)或突變的miR-29a結合位點的lncRNA NEAT1序列，并進行PCR擴增。PCR片段被亞克隆到pMIR-Report質粒(Promega)中熒光素酶基因下游的SacI和HindIII位點。將肺泡上皮細胞接種到24孔板中，培養(yǎng)24 h后，將攜帶野生型或NEAT1突變的pmirGLO報告載體與miR-29a (100 nmol/L)或miR-NC共轉染至肺泡上皮細胞。收集轉染24 h后的細胞裂解，并使用雙熒光素酶報告試劑盒測定熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)值都記錄為至少3個獨立實驗的平均SEM。采用雙尾t檢驗來評價各組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 急性肺損傷患者的血清樣本中，NEAT1表達上調，miR-29a表達下調 qRT-PCR結果表明，與健康者血清相比，NEAT1在缺血再灌注引起急性肺損傷患者的血清樣本表達上調(P<0.001，圖1A)，而miR-29a在缺血再灌注引起急性肺損傷患者的血清樣本表達下調(P<0.001，圖1B)。

2.2 低氧低糖誘導的肺纖維化細胞模型中，敲除NEAT1抑制肺泡上皮細胞肺纖維化進程 通過顯微鏡觀察4組細胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)模型組相對于對照組細胞形態(tài)由鵝卵石型向長梭型變化，而敲除NEAT1可以抑制這種變化(圖2A)；采用Hoechst染色評估細胞凋亡，與對照組相比，模型組細胞凋亡增加，與模型+sh-NC組相比，模型+sh-NEAT1組細胞凋亡受到抑制(P<0.001，圖2B、圖2C)；經Western blot分析，發(fā)現(xiàn)模型組相對于對照組，纖維化標志蛋白col1、col3a1、α-SMA、TGF-β的表達升高，敲除NEAT1可以降低纖維化標志蛋白升高(圖2D、圖2E)；qRT-PCR顯示，相對于對照組，模型組NEAT1表達上調和miR-29a表達下調，而敲除NEAT1使miR-29a表達上調(P<0.01，圖2F、圖2G)。因此，低氧低糖誘導肺泡上皮細胞可以促進細胞凋亡和纖維化，并且使NEAT1表達上調和miR-29a表達下調；敲除NEAT1可以抑制低氧低糖誘導的肺纖維化進程并上調miR-29a表達。

圖1 lncRNA NEAT1和miR-29a在缺血再灌注引起急性肺損傷患者血清樣本中的表達

圖2 細胞水平敲除lncRNA NEAT1對低氧低糖誘導的肺纖維化進程的影響

2.3 缺血缺氧誘導的小鼠肺損傷動物模型中，敲除NEAT1抑制肺組織纖維化進程 在小鼠體內敲除NEAT1，檢測小鼠肺組織纖維化進程以及miR-29a表達。將動物隨機分為對照組、模型組、模型+sh-NC組和模型+sh-NEAT1組，小鼠灌流后取肺切片進行H&E和Masson染色，觀察組織學變化，發(fā)現(xiàn)模型+sh-NEAT1組因缺血缺氧造成的肺纖維化和膠原沉積顯著減少(圖3A)。肺組織HYP含量檢測顯示，模型+sh-NEAT1組因缺血缺氧造成的肺纖維化程度顯著減輕(P<0.001，圖3B、圖3C)。Western blot顯示，模型+sh-NEAT1組相對于對照組和模型+sh-NC組，肺組織纖維化標志物col1、col3a1、α-SMA和TGF-β表達降低(圖3D)。qRT-PCR顯示，相對于對照組，模型組NEAT1表達上調，miR-29a表達下調，而敲除NEAT1使miR-29a表達上調(P<0.001，見圖3E、圖3F)。因此，與體外細胞實驗結果一致，體內敲除NEAT1也會抑制肺纖維化相關指標，進而抑制肺纖維化進程，并且上調miR-29a表達。

2.4 NEAT1靶向miR-29a 為了探索肺纖維化中NEAT1與miR-29a的潛在關系，采用TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)NEAT1與miR-29存在潛在的結合位點(圖4A)。采用RIP技術揭示了NEAT1與miR-29a之間的直接結合關系(P<0.001，見圖4B)。雙熒光素酶報告基因測定揭示NEAT1與miR-29a的靶向關系，發(fā)現(xiàn)miR-29a明顯抑制了攜帶lncRNA NEAT1 3′UTR wt的熒光素酶活性，但當報告質粒攜帶NEAT1 3′UTR mut時，未觀察到明顯的抑制作用(P<0.01，圖4C)。結果顯示，NEAT1可以直接與肺泡上皮細胞中的miR-29a結合，且NEAT1可以負調控miR-29a的表達。

圖3 體內敲除lncRNA NEAT1對缺血缺氧誘導的肺纖維化進程的影響

2.5 抑制miR-29a逆轉了敲除NEAT1對肺纖維化進程的抑制作用 將細胞分為模型+sh-NC組、模型+sh-NEAT1組、模型+sh-NEAT1+anti-miR-NC組和模型+sh-NEAT1+anti-miR-29a組。與模型+sh-NC組相比，模型+sh-NEAT1組細胞形態(tài)由長梭型向鵝卵石樣變化，細胞凋亡減少，纖維化標志蛋白col1、col3a1、α-SMA、TGF-β的表達降低，miR-29a表達增加；而與模型+sh-NEAT1+anti-miR-NC組相比，模型+sh-NEAT1+anti-miR-29a組細胞形態(tài)由鵝卵石樣向長梭型變化(圖5A)，細胞凋亡增加(P<0.001，圖5B、5C)，纖維化標志蛋白col1、col3a1、α-SMA、TGF-β的表達升高(圖5D、圖5E)，miR-29a表達下降(P<0.001，圖5F)。因此，敲除NEAT1抑制肺纖維化進程，而抑制miR-29a逆轉了敲除NEAT1對肺纖維化進程的抑制作用。

圖4 lncRNA NEAT1靶向調控miR-29a

圖5 抑制miR-29a對敲除NEAT1后低氧低糖誘導的肺纖維化進程的影響

3 討論

lncRNA具有調控基因上游啟動子區(qū)、干擾下游基因的表達，介導染色質重構和組蛋白修飾，與轉錄因子結合，與特定MicroRNA結合等多種復雜的調控機制[18]。有研究報道，lncRNA在肺纖維化中也有作用，LncH19通過調節(jié)miRNA-196a/COL1A1軸介導肺纖維化[19]。通過阻斷miR-26a/Smad2來抑制lncRNA PFRL，進而防止肺纖維化[20]。因此，這些lncRNAs可以成為治療肺纖維化的新靶點。核旁體組裝轉錄因子1(NEAT1)是目前基因組數(shù)據(jù)集中調控水平最高的lncRNA之一[21]。有研究證實,lncRNA NEAT1在肝纖維化和腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。但其在低氧誘導的肺纖維化進程中的生物學作用和調控機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1在低氧誘導的肺纖維化組織和細胞中高表達，慢病毒sh-NEAT1轉染細胞和感染小鼠時，可以抑制肺泡上皮細胞的凋亡和降低肺纖維化指標蛋白水平，進而抑制低氧誘導的肺纖維化進程。

microRNAs是一類小的非編碼核糖核酸，通過抑制RNA翻譯來調節(jié)基因表達，調節(jié)細胞功能[16]。許多MicroRNAs，如miR-21[22]、miR-29[23]、miRNA-145[24]、miRNA-199-5[25]和miR-34a[26]等都在肺纖維化中起關鍵作用。其中miR-29家族在人肝硬化組織及CCl4和膽管結扎誘導的小鼠肝損傷模型中呈現(xiàn)低表達，且下調miR-29可減少HSCs的活化[27]。Qin等[28]發(fā)現(xiàn)，miR-29a可能通過下調DNMT3A抑制心肌成纖維細胞的活化和增殖，從而改善心臟纖維化。但miR-29a對肺纖維化的影響未見有報道。本研究結果顯示，miR-29a在低氧誘導的肺纖維化組織和細胞中低表達，通過TargetScan軟件預測發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1與miR-29a可能存在潛在的結合位點，并通過RIP和雙熒光素酶報告檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1靶向結合，且抑制miR-29a可以逆轉敲除lncRNA NEAT1對低氧誘導肺泡上皮細胞的凋亡和降低肺纖維化指標蛋白水平的抑制作用，進而促進了肺纖維化進程。因此，lncRNA NEAT1通過靶向抑制miR-29a促進低氧誘導的肺纖維化進程，然而，此過程中miR-29a下游的靶向基因還不明確。miR-29a常見的靶點包括DNA甲基轉移酶(DNMT)1、DNMT3b、COL1A1、AKT1和AKT2等，其中COL1A1 mRNA水平在特發(fā)性纖維化疾病中升高[29]，提示COL1A1可能作為miR-29a下游的靶向基因來參與lncRNA NEAT1調控的肺纖維化進程。

綜上所述，lncRNA NEAT1促進了低氧時肺泡上皮細胞的凋亡和上調了肺纖維化指標蛋白表達，并通過靶向抑制miR-29a促進低氧誘導的肺纖維化進程，為低氧誘導的肺纖維化治療提供了新的靶點。