高效液相色譜波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定筋骨草中5 種成分含量*

王 淼，管 敏

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

筋骨草始載于清代《本草綱目拾遺》，為唇形科植物筋骨草 Ajuga decumbens Thunb. 的干燥全草，又名白毛夏枯草，具有清熱涼血、解毒消腫、止咳、化痰、平喘功效［1-3］。其植物主要分布于浙江、江蘇、福建等秦嶺以南各省區(qū)，筋骨草、金瘡小草和紫背金盤為同屬近緣種植物，外觀極相似［4-5］。筋骨草主要成分為環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類，具有抗菌、消炎、止咳平喘等作用［6-8］。2015 年版《中國藥典（一部）》筋骨草項(xiàng)下僅以乙酰哈巴苷的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)［9］，乙酰哈巴苷并非筋骨草特有成分，金瘡小草和紫背金盤中也能檢測(cè)出乙酰哈巴苷［4］，故現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以全面控制筋骨草藥材的質(zhì)量。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定筋骨草中哈巴苷、乙酰哈巴苷、木犀草素、芹菜素、杯莧甾酮的含量，為筋骨草藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AR2140 型電子天平（美國 Ohaus 集團(tuán)，精度為0.1 mg）；BP211D 型電子天平（德國 Sartorius 公司，精度為 0.01 mg）；SK6200H 型超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；1260S 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

哈巴苷對(duì)照品（批號(hào)為111729-201204），乙酰哈巴苷對(duì)照品（批號(hào)為111925-201001），木犀草素對(duì)照品（批號(hào)為111520-201605），芹菜素對(duì)照品（批號(hào)為111901-201102），杯莧甾酮對(duì)照品（批號(hào)為111804-201705），均購于中國食品藥品檢定研究院，含量均不低于98%；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；筋骨草藥材飲片（安徽井泉集團(tuán)中藥飲片有限公司，批號(hào)分別為 20160101，20180401，20180501，20180701，20180901）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表 1）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：202 nm（哈巴苷、乙酰哈巴苷）、245 nm（杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序及波長(zhǎng)設(shè)置Tab.1 Gradient elution programs and wavelength setting

2.2 溶液制備

取木犀草素對(duì)照品10.80 mg、芹菜素對(duì)照品9.42 mg和杯莧甾酮對(duì)照品33.61 mg，精密稱定，加甲醇溶解，超聲（功率200 W，頻率40 kHz，下同）處理15 min，加甲醇定容至25 mL，作為對(duì)照品溶液A；稱取哈巴苷對(duì)照品 83.60 mg、乙酰哈巴苷對(duì)照品 45.62 mg，精密稱定，加入對(duì)照品溶液A 10 mL 及適量甲醇，超聲處理15 min，加甲醇定容至20 mL，制成混合對(duì)照品母液；量取5 mL，置 50 mL 容量瓶中，制成每 1 mL 含哈巴苷 418.0 μg、乙酰哈巴苷 228.1μg、木犀草素21.6μg、芹菜素18.84μg、杯莧甾酮67.22 μg 的混合對(duì)照品溶液。取筋骨草藥材飲片粉末約1 g，精密稱定，加入30 mL 甲醇，加熱回流1 h，放冷，濾過，殘?jiān)眉状枷礈? 次，與濾液并入50 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。以甲醇作為陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜見圖1。結(jié)果5 種成分基線均能分離，各峰分離度良好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品母液 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，置 25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素回歸方程分別為 Y1＝3.821 4 X1-1.736 9（R12＝ 0.999 9）、Y2＝ 9.156 4 X2-12.382（R22＝ 0.999 9）、Y3＝ 13.442 X3+4.274 6（R32＝0.999 9）、Y4＝ 84.67 X4-1.137 5（R42＝ 0.999 9）、Y5＝89.22 X5-5.916 4（R52＝0.999 9）。結(jié)果表明，哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素質(zhì)量濃度在33.44 ～ 1 672.00 μg ／mL、18.248 0 ～ 912.40 μg ／mL、5.377 6 ～268.88 μg ／mL、1.728 0 ～ 86.40 μg ／mL、1.507 2 ～75.36 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素峰面積的 RSD 分別為 0.64% ，0.25% ，0.44% ，0.35% ，0.29%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取 2.2 項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)為20160101）適量，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，6，12 h 時(shí)按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素峰面積的 RSD 分別為 0.76% ，0.39% ，3.73% ，1.48% ，2.55% （n ＝ 5），表明供試品溶液在室溫放置 12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20160101）適量，各6 份，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素含量平均值分別為 0.960%，0.830%，0.040%，0.020%，0.014% ，RSD 分別為 0.80% ，0.58%，2.40% ，2.62%，4.68%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)20160101）適量，共 6 份，每份約 0.5 g，分別加入一定質(zhì)量濃度的哈巴苷、乙酰哈巴苷、杯莧甾酮、木犀草素、芹菜素對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

取5 批樣品各適量，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3 次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表3。

3 討論

筋骨草中環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類具有抗菌、消炎、止咳平喘等作用，是發(fā)揮功效的主要成分［7-8］。環(huán)烯醚萜苷類中哈巴苷和乙酰哈巴苷是含量最高的2 種成分，乙酰哈巴苷也是 2015 年版《中國藥典（一部）》［9］中筋骨草項(xiàng)下規(guī)定的質(zhì)量控制指標(biāo)，本課題組前期研究也證實(shí)了筋骨草中哈巴苷和乙酰哈巴苷的抗菌活性。木犀草素、芹菜素是黃酮類中含量較高且有明顯保肝利膽和止咳平喘作用的成分［10-11］，杯莧甾酮也具有抗炎、抗菌活性［12］。因此，本研究中以哈巴苷、乙酰哈巴苷、木犀草素、芹菜素和杯莧甾酮作為筋骨草的質(zhì)量控制指標(biāo)。

乙腈的洗脫能力優(yōu)于甲醇，流動(dòng)相中加入少量的酸性溶液可有效改善峰形。預(yù)試驗(yàn)中先采用0.4%甲酸溶液，但其在202 nm 波長(zhǎng)處有吸收，基線不穩(wěn)，因此選擇乙腈-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，基線平穩(wěn)，各成分峰形較好。哈巴苷和乙酰哈巴苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為202 nm，木犀草素、芹菜素和杯莧甾酮在245 nm 波長(zhǎng)處有較大吸收，因此在0 ～22 min 時(shí)，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為202 nm，22 min后切換波長(zhǎng)為245 nm，通過波長(zhǎng)切換方法實(shí)現(xiàn)多種不同結(jié)構(gòu)成分的同時(shí)測(cè)定，大大提高了檢測(cè)效率。

預(yù)試驗(yàn)中分別比較了乙醇、甲醇、50%甲醇為提取溶劑時(shí)的提取效果，用乙醇提取時(shí)筋骨草藥材飲片中各成分含量均較低；用50%甲醇提取時(shí)哈巴苷和乙酰哈巴苷提取率較高，芹菜素、木犀草素和杯莧甾酮提取率低；用甲醇提取時(shí)5 種成分均有相對(duì)較高的提取率。加熱回流1 h，各成分的提取率顯著高于超聲提取。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n ＝ 6）

表3 樣品中5 種成分含量測(cè)定結(jié)果（%，n ＝3）Tab.3 Results of content determination of five constituents in the samples（%，n ＝3）

不同批次筋骨草藥材飲片中杯莧甾酮的含量差異較大，有的批次未能檢測(cè)出杯莧甾酮，可能與杯莧甾酮的穩(wěn)定性有關(guān)。其應(yīng)在低溫（0 ～10 ℃）下避光保存，如長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，含量會(huì)降低。因此，筋骨草藥材在加工、炮制、儲(chǔ)存過程中，應(yīng)注意杯莧甾酮的不穩(wěn)定性。

中藥成分復(fù)雜，與療效相關(guān)的多指標(biāo)控制是中藥質(zhì)量管理的必然發(fā)展趨勢(shì)［13］。本研究中在2015 年版《中國藥典（一部）》筋骨草質(zhì)量控制基礎(chǔ)上，建立了HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定筋骨草中5 種成分的含量，方法高效、簡(jiǎn)便，可重復(fù)，可為筋骨草藥材及其制劑質(zhì)量控制提供參考。