果蠅培養(yǎng)條件優(yōu)化和唾液腺染色體標(biāo)本制備技術(shù)改進(jìn)

（廣東省韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院 廣東潮州 521041）

果蠅具備染色體基數(shù)少、世代周期短（10～15d）、子代個(gè)數(shù)眾多、可遺傳突變性狀多樣的特點(diǎn)，因此是科學(xué)研究領(lǐng)域服務(wù)時(shí)間較長(zhǎng)、研究較為深入的模式生物之一。通過(guò)眾多科學(xué)研究者的試驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)存在于果蠅唾液腺的巨大染色體是觀察染色體畸變?nèi)缛笔А⒅貜?fù)、倒位的最佳材料。因此，果蠅唾液腺染色體的觀察也是遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。如何快速獲取品質(zhì)優(yōu)良的果蠅唾液腺材料并且簡(jiǎn)便制成清晰度高的染色裝片，是順利開(kāi)展遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)首要解決的問(wèn)題。下面將在果蠅幼蟲(chóng)的培養(yǎng)、唾液腺的剖離、唾液腺的解離、染色、壓片等方面進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。

1 果蠅幼蟲(chóng)培養(yǎng)基的選擇

目前大多實(shí)驗(yàn)室所飼養(yǎng)的果蠅為黑腹果蠅，而適用于三齡幼蟲(chóng)培養(yǎng)的品系是野生型黑腹果蠅，它的適應(yīng)力強(qiáng)，繁殖能力也強(qiáng)，而且在野外環(huán)境也能采集到。教材中常用玉米粉紅糖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)較為豐富，但是配置步驟較多，而且需要添加適量防腐劑去抑制霉菌的生長(zhǎng)。筆者發(fā)現(xiàn)釀制米酒的酒糟不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，飼養(yǎng)蟲(chóng)體肥大，還能儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)需再添加其他防腐劑，這與酒糟中所含低度酒精有關(guān)。因此，直接選用糯米酒的酒糟作為培養(yǎng)果蠅三齡幼蟲(chóng)的培養(yǎng)基。為了方便挑取和觀察幼蟲(chóng)的形態(tài)大小，選擇直徑為15～20 cm大培養(yǎng)皿（大小皿蓋盡量貼合，防止成蟲(chóng)逃逸）作為培養(yǎng)專(zhuān)用器具，使用前要消毒處理。添加酒糟的高度不超過(guò)小皿蓋的1/2，這么做可以保證果蠅成蟲(chóng)的活動(dòng)空間，也能為幼蟲(chóng)提供充裕的養(yǎng)分。

2 果蠅幼蟲(chóng)的培養(yǎng)溫度

由表1可知，果蠅的最適培養(yǎng)溫度為25℃，但是三齡幼蟲(chóng)適宜溫度為17～18℃。為此，在接入果蠅成蟲(chóng)1～3 d的培養(yǎng)溫度設(shè)為25℃，有利于快速產(chǎn)卵，第四天則改為18℃，有助于幼蟲(chóng)減少活動(dòng)，加快進(jìn)食，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體內(nèi)快速積累。待到15～18 d，可以觀察到數(shù)量眾多的三齡幼蟲(chóng)出現(xiàn)在皿壁上。

表1 培養(yǎng)溫度對(duì)果蠅生長(zhǎng)周期的影響

3 果蠅唾液腺的剖離

此時(shí)，要選擇以附著在皿壁、活動(dòng)緩慢、個(gè)體肥大的三齡幼蟲(chóng)。提取的器具可用大頭針的鈍端、牙簽。由于三齡幼蟲(chóng)表面會(huì)有食物殘?jiān)蚍置谖?，可采用生理鹽水對(duì)其進(jìn)行沖洗。沖洗完畢的幼蟲(chóng)可轉(zhuǎn)到冰塊上快速麻醉處理，方便后續(xù)剖離操作。再將蟲(chóng)體轉(zhuǎn)移到干凈載玻片上，雙手各持一只大頭針，用左手的大頭針將幼蟲(chóng)尾部輕壓固定好，接著用右手的大頭針尖端準(zhǔn)確點(diǎn)到黑色口器部位，徑直向前拉伸。學(xué)生暫時(shí)不能確切判斷唾液腺所在位置，因此需要把帶有蟲(chóng)體載玻片放到體視鏡下觀察。唾液腺的鏡檢特征為一對(duì)上小下大的囊狀半透明結(jié)構(gòu)，形似絲瓜，通常附有帶狀灰白色脂肪體，緊連著黑色口器。建議先把蟲(chóng)體尾部直接去除，再小心挑去口器、腸道等器官。

4 果蠅唾液腺的低滲、解離

添加1或2滴蒸餾水，處理2～3 min，促使唾液腺的細(xì)胞破裂、染色體盡量分散。用吸水紙小心吸取多余的水，再滴加1或2滴物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的鹽酸，促使細(xì)胞解離，有利于染色液更好滲透。同樣用吸水紙吸取多余的酸液。

5 唾液腺的染色

將改良苯酚品紅染液滴入充分解離的材料，靜置染色10～15 min。完成染色后，不要急于壓片，而是將染色的材料放到高倍鏡下觀察唾液腺細(xì)胞內(nèi)核膜未撐破，巨大染色體呈線團(tuán)般緊密纏繞的形態(tài)，讓學(xué)生對(duì)巨大染色體有初步印象，避免與腸道殘留細(xì)胞核的“張冠李戴”。

6 壓片

用鑷子夾取潔凈無(wú)痕的蓋玻片，蓋玻片接觸材料的外圍染液并與載玻片的接觸點(diǎn)保持45°斜角，緩緩地下降，確保兩者接觸面不出現(xiàn)氣泡。把兩張稍大于載玻片的吸水紙覆蓋在蓋玻片上，左手的拇指和食指分別輕輕地固定吸水紙與蓋玻片重疊的對(duì)角，右手拇指朝著蓋玻片的中央位置用力壓平。切勿來(lái)回搓動(dòng)，否則染色體的結(jié)構(gòu)會(huì)嚴(yán)重變形。

7 鏡檢結(jié)果

判斷制作良好裝片的標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞膜及核膜已破，染色體分散良好，橫紋分帶清晰度高，背景較干凈。教師可以選取染色體臂分散良好的玻片，指導(dǎo)學(xué)生觀察染色中心、蓬突、橫紋、間紋，引導(dǎo)學(xué)生思考為何果蠅染色體數(shù)是2n=8，唾液腺細(xì)胞染色體卻呈現(xiàn)放射狀5長(zhǎng)1短的6條臂。

8 結(jié)果與討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，制片的改進(jìn)之處在于：①培養(yǎng)基原料改為釀制米酒的酒糟。果蠅以酵母菌為食，酒糟能夠提供大量酵母菌，而且酒糟中還富含糖類(lèi)、蛋白類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，非常有助于幼蟲(chóng)生長(zhǎng)和儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)酒糟作為釀酒副產(chǎn)品是不難獲得的。②幼蟲(chóng)的輕度麻醉，冷凍法能夠避免有機(jī)溶劑如乙醚的環(huán)境污染問(wèn)題，且簡(jiǎn)單易行。③對(duì)唾液腺細(xì)胞低滲和酸解的處理，是促使細(xì)胞膜、核膜破裂的有效方法之一。④壓片的手法技巧必須明確的是染色體臂分散開(kāi)來(lái)的力量為快速準(zhǔn)確地?cái)D壓。