多重處理對(duì)華重樓種子休眠解除的影響

譚秋生，章文偉，徐 廣，鄧才富，任星宇，羅 敏，楊永東，羅 川

(重慶市藥物種植研究所 中藥材質(zhì)量控制研究中心，重慶 408435)

全世界共有24種重樓植物品種，我國(guó)有19種[1]。云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.和七葉一枝花(華重樓)ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara為名貴中藥材重樓的正品來(lái)源[2]。因其生長(zhǎng)緩慢，自種子育苗到藥材采收至少需要7～10年，加上種植技術(shù)薄弱、市場(chǎng)需求量大等原因，供需矛盾十分突出，不僅價(jià)格攀高，野生資源也遭受掠奪式采挖，面臨枯竭。人工種植是緩解供需矛盾和保護(hù)野生資源的重要途徑，種子育苗更是大面積種植的重要種苗來(lái)源，因其具有品種易控、繁育量大和成本較低等優(yōu)點(diǎn)。

采取合理措施打破休眠是重樓種子快速育苗的關(guān)鍵。重樓植物在果實(shí)成熟時(shí)種子的胚發(fā)育不全，胚芽、胚軸、胚根和子葉都還未形成，外加胚乳堅(jiān)硬、內(nèi)種皮表層角質(zhì)化等原因，其種子存在形態(tài)后熟和生理休眠特性，需要經(jīng)過(guò)胚的形態(tài)建成和種子內(nèi)源抑制物解除兩個(gè)過(guò)程才能萌發(fā)[3-6]。研究表明，滇重樓種子內(nèi)種皮與胚乳不存在吸水障礙[7-8]，外種皮及胚乳均含有抑制種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的物質(zhì)，胚乳抑制作用強(qiáng)于外種皮[8-10]，種子種胚休眠解除是抑制物質(zhì)(ABA)減少與促萌物質(zhì)(GA3)增加和積累的結(jié)果[11]。

赤霉素(GA3)是重樓種子休眠解除研究最常用的一種激素，效果也較好，可能與影響種子中α、β淀粉酶加速淀粉降解促進(jìn)可溶性糖積累有關(guān)[12]，浸種濃度一般50～500 mg·L-1。10%硫酸浸泡重樓種子可軟化內(nèi)種皮，提高萌發(fā)率[13]。合適的超聲波處理可縮短重樓種子萌發(fā)時(shí)間，提高發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)[14-15]。目前，未見(jiàn)稀硫酸、GA3和超聲波三者聯(lián)合處理對(duì)重樓種子休眠解除的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)采用10%硫酸首浸+超聲+ GA3再浸模式強(qiáng)化華重樓種子層積前處理，恒溫沙藏后定期觀察種子萌發(fā)情況，對(duì)各種處理后的休眠破除效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選最佳處理組合，為華重樓種子快速育苗提供技術(shù)支持。

1 材料與試劑

1.1 儀器

AL-104電子天平(梅特勒-托利多儀器公司)；LRHS-150-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)；KQ3200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TW12通用水浴槽(德國(guó)JULABO)；240 mL組培玻璃瓶。

1.2 試劑

95%赤霉素(GA3，河南新雨化工科技有限公司)；50%多菌靈可濕性粉劑(四川潤(rùn)爾科技有限公司)；硫酸、無(wú)水乙醇、氯化汞(分析純)；純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 材料

試驗(yàn)種子于2018年10月29日購(gòu)買自四川省萬(wàn)源市玉帶鄉(xiāng)曹家山村，經(jīng)本單位章文偉副研究員鑒定為七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara的帶新鮮紅色外種皮種子。試驗(yàn)前，種子加水40 ℃浸泡48 h，然后在不銹鋼篩網(wǎng)上，反復(fù)用手搓揉種子和加水清洗，除凈紅色外種皮，得白色凈種子，以下簡(jiǎn)稱白籽，陰干，過(guò)圓孔篩(Φ3 mm)，收集篩面上表面光亮、子粒飽滿種子，備用。

2 方法

2.1 種子準(zhǔn)備

備足50 mL小燒杯，每杯隨機(jī)計(jì)量數(shù)入100粒白籽，每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2.2 首浸

除對(duì)照(CK)外，每杯加入10%硫酸20 mL，分別室溫浸泡10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，倒出硫酸廢液，種子加水2次透洗。

2.3 超聲

包括對(duì)照(CK)，每杯加水30 mL，置超聲波清洗器中，保持水溫40 ℃，超聲(150 W、40 kHz)50 min，倒出種子瀝干后裝回原杯。

2.4 再浸

除對(duì)照(CK)用純水外，每杯加入100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1和500 mg·L-1GA3溶液20 mL，用保鮮膜封口，置于水浴槽中25 ℃、避光浸泡24 h，倒出赤霉素廢液，種子加水2次透洗后倒出瀝干。

2.5 層積濕沙制備

干河沙過(guò)篩，收集直徑0.5 mm下的細(xì)沙粒，130 ℃干熱滅菌4 h，冷卻后，加入沙量2%的50%多菌靈粉劑，拌勻，按30%～40%含水量加水，攪勻。河沙濕度控制在“手握成團(tuán)，輕捏即散”的狀態(tài)，即可。

2.6 裝瓶和沙藏

取上述復(fù)合處理后的干白籽，用75%酒精浸泡1 min、再用0.15% HgCl2浸泡10 min，純水透洗3次，瀝干后，與50 g濕沙拌勻后裝入玻璃組培瓶中，確認(rèn)種子都被沙覆蓋后，旋緊蓋子，放入20 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究將種子露白，胚根突破種皮1 mm視為萌發(fā)。試驗(yàn)4個(gè)月，分別于54 d、82 d和110 d共3次對(duì)沙藏種子進(jìn)行集中觀察，選出已萌發(fā)種子，清除腐爛種子，按萌發(fā)率(%)=萌發(fā)種子累計(jì)數(shù)/試驗(yàn)種子數(shù)×100%計(jì)算各期萌發(fā)率，數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2010處理后用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用S-N-K檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度GA3浸種對(duì)華重樓種子萌發(fā)的影響

華重樓白籽直接加水超聲后再用不同濃度GA3浸泡后沙藏，各期萌發(fā)率見(jiàn)表1。先后3次觀察，均以400 mg·L-1GA3(簡(jiǎn)稱N400，下同)組最佳，萌發(fā)率最高，分別為39.00%、41.00%和80.00%，與其他濃度組均有顯著差異。前兩次，只有N400超過(guò)CK，分別超出1.33%、9.33%，差異較??；第3次，N400和N100均超過(guò)CK，分別超過(guò)45.33%、30.66%，差異較大。赤霉素浸泡對(duì)華重樓種子休眠解除有一定作用，但無(wú)明顯影響規(guī)律。試驗(yàn)表明，華重樓種子超聲+GA3浸泡模式中，最佳GA3濃度為400 mg·L-1，其次為100 mg·L-1，種子萌發(fā)速度及萌發(fā)率均較高，萌發(fā)率分別為80.00%和65.33%。

表1 華重樓種子不同濃度GA3浸泡后萌發(fā)率

3.2 10%硫酸不同時(shí)間浸種對(duì)華重樓種子萌發(fā)的影響

華重樓白籽用10%硫酸浸泡不同時(shí)間后再加水超聲后沙藏，各期萌發(fā)率見(jiàn)表2。先后3次過(guò)程觀察，均以50 min(簡(jiǎn)稱M50，下同)組最佳，萌發(fā)率最高，分別為40.00%、77.33%和85.33%。第1次，僅有M50超出CK 12.33%，M40與CK相近；第2次，M20、M40和M50分別超出CK 28.33%、33.66%和45.66%；第3次，M10、M20、M40和M50分別超出CK 27.33%、30%、46.33%和50.66%。第1、2次，M50與其他時(shí)間組均有顯著差異；第3次，M50與除M40外的時(shí)間組有顯著差異。10%硫酸浸泡對(duì)華重樓種子休眠解除有一定作用，但也無(wú)明顯影響規(guī)律。試驗(yàn)表明，華重樓種子10%硫酸浸泡+超聲模式中，最佳浸泡時(shí)間為50 min，其次為40 min，種子萌發(fā)速度及萌發(fā)率均較高，萌發(fā)率可達(dá)到80.00%以上。

表2 華重樓種子用10%硫酸浸泡不同時(shí)間萌發(fā)率

3.3 10%硫酸、超聲波與GA3聯(lián)合處理對(duì)華重樓種子萌發(fā)的影響

華重樓白籽經(jīng)10%硫酸不同時(shí)間浸泡、超聲和不同濃度赤霉素(GA3)浸泡后沙藏，第3次(110 d)種子萌發(fā)率見(jiàn)表3。僅有M10+超聲+N400萌發(fā)率超過(guò)90.00%；萌發(fā)率80%～90%有6組，分別為M20+超聲+N400、M40+超聲+N400、M40+超聲+N300、M10+超聲+N100、M40+超聲+N100和M30+超聲+N400。三組最差，萌發(fā)率<10%，分別為M10+超聲+N200、M20+超聲+N100和M20+超聲+N300。表明10%硫酸+超聲+GA3模式可有效解除華重樓種子休眠，提高萌發(fā)率，最佳組合為M10+超聲+N400，其次為M30+超聲+N400。GA3濃度、10%硫酸浸泡時(shí)間分別以400 mg·L-1和40 min為宜。

表3 不同組合處理后沙藏種子萌發(fā)率

方差分析結(jié)果(表4)顯示：10%硫酸(min)，F(xiàn)=171.834，P<0.01，差異極顯著；GA3(mg·L-1)，F(xiàn)=442.240，P<0.01，差異極顯著；10%硫酸(min)*GA3(mg·L-1)，F(xiàn)=160.915，P<0.01，差異極顯著。表明去除紅外種皮華重樓種子層積前處理時(shí)10%硫酸浸泡時(shí)間和GA3濃度對(duì)其休眠解除后萌發(fā)影響都極顯著。10%硫酸浸泡40 min、50 min效果較好，與CK、浸泡10 min、20 min和30 mim均有顯著差異(表5)；GA3浸泡以400 mg·L-1濃度最佳，與其他濃度組有顯著差異(表6)。相關(guān)性分析結(jié)果(表7)表明10%硫酸浸泡時(shí)間與種子萌發(fā)率呈極顯著正相關(guān)，GA3浸泡濃度與種子萌發(fā)率呈負(fù)相關(guān)，影響不顯著。

表4 10%硫酸聯(lián)合GA3浸泡后萌發(fā)率的方差分析結(jié)果

表5 10%硫酸不同時(shí)間浸泡萌發(fā)率均數(shù)的兩兩比較 (S-N-K法)

表6 不同濃度GA3浸泡萌發(fā)率均數(shù)的兩兩比較 (S-N-K法)

表7 10%硫酸浸種時(shí)間與GA3浸種濃度對(duì)種子萌發(fā)率的相關(guān)性分析

4 討論

相同超聲條件下，10%硫酸或GA3浸泡對(duì)華重樓種子休眠解除、促進(jìn)萌發(fā)均有一定作用，但無(wú)明確影響規(guī)律。單因素考察，10%硫酸最佳浸泡時(shí)間為50 min、其次為40 min，GA3浸泡最佳濃度為400 mg·L-1，萌發(fā)率均可達(dá)到80%及以上。10%硫酸、超聲和GA3聯(lián)合處理，6種組合種子萌發(fā)率均可達(dá)80%以上，以10%硫酸10 min+超聲+400 mg·L-1GA3組合萌發(fā)效果最好，萌發(fā)率高達(dá)96.67%。10%硫酸浸泡時(shí)間和GA3濃度對(duì)去皮華重樓種子萌發(fā)都有極顯著影響，10%硫酸浸泡時(shí)間與萌發(fā)率呈極顯著正相關(guān)，GA3濃度與萌發(fā)率呈負(fù)相關(guān)，但影響不顯著。本試驗(yàn)只對(duì)20 ℃恒溫層積效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，文獻(xiàn)多主張高低變溫層積，通過(guò)這種強(qiáng)化前處理的組合措施，變溫試驗(yàn)是否會(huì)取得更好效果，還有待進(jìn)一步研究。

本研究主要考慮到重樓種子具有內(nèi)種皮表層角質(zhì)化、胚乳堅(jiān)硬且含萌發(fā)抑制物等特點(diǎn)，在現(xiàn)有文獻(xiàn)[13，16-17]的基礎(chǔ)上，以強(qiáng)化前期處理盡量縮短種子層積時(shí)間為目標(biāo)，分別選用10%硫酸浸種軟化種皮提高種子透水性、40 ℃超聲(150 W、40 kHz)50 min置換種子抑制萌發(fā)物和赤霉素溶液25 ℃再浸種24 h增加促萌物質(zhì)。試驗(yàn)用華重樓白籽百粒重4.5 g左右，其生活力采用0.1%TTC染色法[18]測(cè)定為92.0%。

項(xiàng)目組還對(duì)GA3拌濕河沙層積效果進(jìn)行了考察，具體方法為華重樓白籽10%硫酸浸泡20 min+超聲+水浸泡處理后埋藏于不同濃度GA3拌濕河沙中層積。結(jié)果表明，隨GA3濃度增加對(duì)華重樓種子萌發(fā)表現(xiàn)一定抑制作用，最宜100 mg·L-1，萌發(fā)率90.53%；相同濃度GA3，拌濕河沙層積效果優(yōu)于再浸種。原因可能有二：①用水替換GA3再浸種可置換出更多抑萌物質(zhì)；②GA3拌沙，沙中GA3含量較高和殘留更持久，種子長(zhǎng)時(shí)間被GA3包圍，作用更充分，從而影響其萌發(fā)。赤霉素拌沙層積技術(shù)對(duì)后續(xù)種子發(fā)芽出苗及生長(zhǎng)有何影響，以及是否適合推廣都還有待進(jìn)一步研究。