基于玄府氣血理論研究風藥組方對血管性癡呆大鼠海馬突觸興奮性氨基酸受體的影響

唐 慧，白 雪，李雙陽

(1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

血管性癡呆(Vascular dementia，VaD)是一類由于腦血管損傷引起的進行性神經(jīng)退行性疾病，其影響記憶和認知能力[1]。該病機制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，病程進展緩慢，患病人數(shù)不斷增加，是老年性癡呆最常見的病因之一[2]。VaD是可逆的，早期預(yù)防和治療可減輕患者痛苦，預(yù)防疾病發(fā)展[3]。目前，VaD的發(fā)病機制尚不完全清楚，慢性腦灌注不足是VaD的重要病因，突觸可塑性損傷在VaD發(fā)病機制中的作用日益受到關(guān)注[4]。突觸可塑性損傷是參與腦血管病介導出現(xiàn)認知障礙導致VaD的主要環(huán)節(jié)。突觸膜上存在著NMDA受體和AMPA受體，這些受體被激活后，蛋白磷酸化增強，促使Ca2+大量流入突觸后神經(jīng)元產(chǎn)生突觸后電位，誘導腦區(qū)長時程增強(Long term potentiation，LTP)；而神經(jīng)元內(nèi)CREB的磷酸化通過表達調(diào)控BDNF因子的過程對突觸形成、突觸膜上氨基酸受體的活動緊密相關(guān)[5]。因各種因素致慢性腦缺血發(fā)生，大腦內(nèi)部供能不良，引起NMDA受體介導的Ca2+內(nèi)向活動過多，細胞內(nèi)Ca2+濃度過高，則造成細胞死亡致遲發(fā)性神經(jīng)變性，突觸丟失，是VaD發(fā)病的機制之一[6]。因此，在繼承名中醫(yī)王明杰教授玄府理論學說的基礎(chǔ)上，課題組提出：癡呆之為病，是腦玄府郁閉也，當治以重風藥之功，開通玄府、復(fù)聰用神[7]。既往研究已表明：風藥組方可保護腦灌注不足后導致的海馬細胞凋亡，增加海馬突觸數(shù)量，縮短增寬的突觸間隙，使突觸后致密區(qū)染色加深、活性區(qū)變長，具有恢復(fù)突觸的正常結(jié)構(gòu)及提高突觸傳遞效能的作用[8]，但其具體病理機制仍不清楚。因此，本實驗通過誘導VaD大鼠模型，研究風藥組方對VaD大鼠模型行為學、海馬pCREB、BDNF及突觸膜上興奮性氨基酸受體亞基蛋白表達的影響，從腦玄府-突觸角度探討風藥組方治療VaD大鼠的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只250～300 g的健康雄性Sprague-Dawley成年大鼠，購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心(生產(chǎn)和使用許可證：SCXK(川)019-17；SCXK(川)019-065)，所有大鼠均按照5只/籠分籠飼養(yǎng)，房間安靜，在恒溫(25±2)℃、濕度50%～55%、光/暗循環(huán)12 h的受控環(huán)境中飼養(yǎng)，食物和水均自由獲取。

1.2 實驗藥物

通竅益智顆粒：麻黃6 g(產(chǎn)地新疆)、川葛15 g、黃芪30 g(產(chǎn)于甘肅)、地龍10 g(產(chǎn)地廣東)、水蛭3 g(產(chǎn)地河北)等)，使用中藥材均由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，且經(jīng)該院主任中藥師鑒定均為正品。制法：地龍、水蛭先經(jīng)70%乙醇浸泡1周后提取，石菖蒲則提取揮發(fā)油，然后所有藥材一同水煎3次，過濾殘渣，濃縮，制備成2 g/mL濃縮液。尼莫地平(30 mg/片)(批號H0003010)，灌胃前配制成2 mg/mL的溶液。

1.3 主要試劑與儀器

試劑：RIPA組織裂解液(Solarbio，R0010)；雞尾酒片(Roche，0589791001)；Marker(ThermoFisher，6616)；牛血清白蛋白BSA(博士德，A800-5g)；Anti-pCREB(9198)、Anti-GluN1(5704)、Anti-GluNB(14544)、Anti-GluA (13607S)以及Anti-β-actin(4970)，均購自Cell Signaling Technology；Anti-BDNF(Abcam，ab108319)；WB、IHC通用型二抗(羊抗兔IgG抗體，天津三箭，LK 001)；BCA試劑盒(碧云天，P0010S)；發(fā)光液ECL(wandao，PE001+PE002)。

儀器：瑞士METTLER TOLEDOML-T電子天平；成都泰盟Morris水迷宮；德國Leica RM2016石蠟切片機；日本Olympus Inc：BX52顯微鏡、DP70圖像采集系統(tǒng)；瑞士KINEMETICA POLYTRON?機械組織勻漿機；德國Eppendorf 5424臺式高速低溫離心機；美國Bio-Rad ChemiDocTMXRS+ System凝膠成像分析儀。

1.4 動物分組、造模與給藥

術(shù)前大鼠隨機分為：手術(shù)組和假手術(shù)組。手術(shù)組：采取2-VO法[9]制備VaD大鼠模型；假手術(shù)組：給予相同手術(shù)方式，但未結(jié)扎。造模后予以肌肉注射青霉素鈉80 000 IU/d，連續(xù)3 d。術(shù)后28 d以Morris水迷宮試驗(MWMT)測試大鼠的潛伏逃避期(escape latency，EL)，然后挑選出建模合格的大鼠，共50只，隨機分為模型組、尼莫地平組(6.25 mg·kg-1·d-1)、通竅益智顆粒高(24.8 g·kg-1·d-1)、中(12.4 g·kg-1·d-1)、低劑量組(6.2 g·kg-1·d-1)，每組10只，中藥組每天分別給予12.4 mL/kg、6.2 mL/kg、3.1 mL/kg，溶解尼莫地平片后以2 mL/kg的劑量給藥，假手術(shù)組和模型組則給予等體積雙蒸水，共計灌飼30 d。

1.5 標本采集

停止灌胃后，使用MWMT評估不同組大鼠認知能力，完成后，術(shù)前12 h禁食，將大鼠腹腔注射麻醉(4%水合氯醛)，仰臥位固定于操作臺，剪開膈肌，暴露心臟，切開心臟右心耳，用注射針尖從心室進入升主動脈后立即注入100～200 mL的0.9%氯化鈉，待流出液體變淡，肺組織變白，肝組織呈淺褐色結(jié)束，立即斷頸取腦，冰中分離左右海馬并放入預(yù)先編號的組織管內(nèi)，置液氮速凍備用。進行組化檢測的大鼠在0.9%氯化鈉灌流后，再以4%多聚甲醛溶液注入至大鼠抖動變僵，迅速取出全腦組織，裝入含有4%多甲溶液的EP管內(nèi)。

1.6 指標檢測方法

1.6.1 Morris水迷宮評價行為學改變 ①定位航行實驗：本次實驗在第Ⅲ象限設(shè)置平臺，在水中加入適量二氧化鈦，將大鼠依次從第Ⅰ到Ⅳ區(qū)域象限面向壁側(cè)放入水中，大鼠在90 s內(nèi)到達平臺并停留大于3s即停止錄像，該過程所耗的時間即潛伏逃避期(EL)。若在設(shè)定時間內(nèi)找不到平臺，則引至平臺停留30 s，記EL為120 s。每只大鼠每日不同4個時間點進行訓練，連續(xù)5天，記錄第5天的EL。②空間探索實驗：第6天則移去隱藏平臺，將大鼠釋放到任意一個區(qū)域，在120 s內(nèi)記錄大鼠在目標范圍游泳時間的長短及圍繞原設(shè)置平臺游的次數(shù)，每天1次，連續(xù)2 d。

1.6.2 免疫組化檢測海馬CA1神經(jīng)元BDNF表達 將全腦組織取出，常規(guī)法石蠟包埋，用切片機將標本切出厚度為3～5 μm的切片，貼附于載片上，經(jīng)脫水、脫蠟操作后，在0.01 mol/L枸櫞酸鈉液中進行高壓抗原提取，然后封閉，第一第二抗體孵育后染色，再進行蘇木精復(fù)染，沖洗，封片，通過選取切片同一區(qū)域的3個不重疊視野，在顯微鏡400倍數(shù)下觀察圖像。最后用Image J軟件分析圖像，計算蛋白的表達量。

1.6.3 Western Blot檢測pCREB和GluN1、GluN2B、GluA2的表達 海馬組織在低溫RIPA緩沖液中勻漿，提取蛋白，BCA法測蛋白水平，蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸冷卻，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上，膜以5%BSA封閉，并與第一抗體在4 ℃孵育過夜：抗pCREB(800x)，抗GluN1、抗GluNB、抗GluA (1 000x)，隨后與第二抗體孵育。用ECL試劑在成像系統(tǒng)中觀察蛋白條帶。利用Image Lab軟件進行靶蛋白條帶密度測定。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學的變化

表1顯示，假手術(shù)組、模型組和藥物治療組的EL呈縮短趨勢，各手術(shù)組與假手術(shù)組相比顯示出了明顯的記憶差距，其EL明顯延長(P<0.05)，各藥物治療組的EL均明顯優(yōu)于模型組(P<0.05)，以通竅益智顆粒24.8 g/kg組變化最為顯著(P<0.05)。在第6天后，模型組、藥物治療組在隱藏平臺及第Ⅲ象限活動的時間及次數(shù)較假手術(shù)組不同程度減少(P<0.05)。治療后，各藥物組越過平臺次數(shù)及第Ⅲ象限游泳時間均有所增長(P<0.05)，以上改變以通竅益智顆粒24.8 g/kg組最為顯著(P<0.05)。

2.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元CA1 BDNF的表達

結(jié)果顯示，BDNF在神經(jīng)元細胞內(nèi)(主要在胞漿內(nèi))表現(xiàn)出呈棕黃色或棕褐色沉淀(圖1)；與假手術(shù)組比較，BDNF的陽性區(qū)域面積在各組間有顯著差異，陽性區(qū)域面積明顯降低(P<0.05)。而藥物治療組的BDNF表達量明顯多于模型組(P<0.05)；其中以通竅益智顆粒24.8 g/kg組升高最為顯著(P<0.05)。

2.3 各組大鼠海馬pCREB和突觸GluN1、GluN2B、GluA2的表達

通過Western Blot檢測海馬區(qū)興奮性谷氨酸受體亞基pCREB、GluN1、GluN2B和GluA2發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)給藥的VaD大鼠海馬pCREB、GluN1、GluN2B和GluA2蛋白表達量顯著減少(P<0.05)，而經(jīng)藥物治療后的VaD大鼠，則逆轉(zhuǎn)了海馬pCREB及上述3個受體亞基蛋白表達，顯示出上調(diào)趨勢(P<0.05)。其中通竅益智顆粒24.8g/kg組pCREB、GluN1、GluN2B、GluA2的表達水平高于其余各給藥組(P<0.05)。詳見表3。

表2 通竅益智顆粒對VaD大鼠海馬CA1 BDNF表達的影響

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.陽性對照組；D.中藥高劑量組；E.中藥中劑量組；F.中藥低劑量組

表3 通竅益智顆粒對VaD大鼠海馬pCREB、GluN1、GluN2B、GluA2表達的影響

圖2 通竅益智顆粒對VaD大鼠海馬神經(jīng)元pCREB、GluN1、GluN2B、GluA2蛋白表達情況

3 討論

腦部活動的良好運行需要有充足而連續(xù)的血供維持，而其中大量的能量用于大腦皮質(zhì)神經(jīng)元觸發(fā)突觸離子泵并使其耗散的離子濃度梯度恢復(fù)活動，同時一些神經(jīng)細胞如星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞也與腦血管存在相互代謝相互調(diào)節(jié)與依賴的狀態(tài)[10]。大多腦血管病變?nèi)鐒用}粥樣硬化，或心源性因素(心臟驟停、血流動力學所致的心律失常等)，以及其他因素導致的小血管堵塞、微出血、低灌注，都可不同程度地導致認知功能障礙[11]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為，癡呆的發(fā)病分虛實兩端，或精虧髓減，腦失所養(yǎng)；或邪犯清竅，元神失用[12]，以腎虛為本，夾以痰、瘀、火、毒等實邪，組方大多專注于益腎填髓、化瘀通絡(luò)、清火祛痰、補脾益氣、解毒開竅等角度。

氣動則神機轉(zhuǎn)。氣是宇宙萬物之本原，維系生命活動與自然界之間的物質(zhì)、信息、能量交換活動，是構(gòu)成人體生命活動運動不息、至微至細的物質(zhì)。正所謂“氣和而生，津液相成，神乃滋生”，可看出有氣的基礎(chǔ)后才有“神”的產(chǎn)生，形為神體，神為體用，二者互為體用，借助于氣、血、津液的運行，神機才能體現(xiàn)。而我們稟受于父母的先天之精氣、呼吸自然界之清氣及中焦化生之精氣構(gòu)成了人體之氣的來源；物質(zhì)能為生理機能產(chǎn)生源源不斷的能量，如ATP能量的產(chǎn)生依賴于有機物的三羧酸循環(huán)，因此，氣與現(xiàn)代醫(yī)學中的能量具極大相似性[13]。

在調(diào)控LTP的活動中，cAMP/PKA-CREB通路發(fā)揮著重大作用。CREB激活后，NMDA受體引發(fā)的LTP活動進一步增強，并觸發(fā)更多的沉默突觸產(chǎn)生，為功能性突觸的修飾與產(chǎn)生提供物質(zhì)基礎(chǔ)[17，18]，進而對突觸可塑性和記憶方面提供有利條件。BDNF為CERB下游的靶基因之一，其磷酸化調(diào)控BDNF表達，在突觸活動中，可通過上調(diào)下游蛋白結(jié)合穩(wěn)定細胞骨架，抑制內(nèi)收蛋白失活，促進突觸活動發(fā)揮神經(jīng)保護作用[19]。同時，BDNF參與NMDA 和AMPA受體亞基蛋白的表達，影響突觸后活動的過程，提高其傳遞效率與功能[19-20]。此外，BDNF與樹突部位的TrkB受體結(jié)合可將PSD-95運輸至其他樹突處以刺激突觸的形成[21]。

當腦部血供減少后，cAMP/PKA-CREB信號通路開始發(fā)生變化：第一，cAMP的合成下降，隨之相關(guān)的PKA、CREB及BDNF等關(guān)鍵基因蛋白下調(diào)，使LTP活動減弱。其次，由于大腦神經(jīng)元對缺血缺氧的環(huán)境有極大敏感性，腦缺血發(fā)生后的短時間內(nèi)，海馬神經(jīng)元和突觸均出現(xiàn)不可逆損傷，海馬神經(jīng)元細胞凋亡，胞內(nèi)線粒體、核糖體等數(shù)量降低，加上灌注不足帶來的一系列如氧化應(yīng)激、炎癥等反應(yīng)更進一步導致神經(jīng)元損傷，致使突觸損壞，從而使海馬記憶功能受損[22]。而前文談到，神機交互需依賴于腦玄府對氣血的正常運行[23]。玄府通闔功能有常，氣血暢通，邪無所留，神機運轉(zhuǎn)靈活；而當玄府失利，氣血運行受阻，一則神機失去物質(zhì)基礎(chǔ)無以化生，二則神機交互失所，神機失用，故表現(xiàn)為呆癥[23-24]。玄府功能的維系也需氣血的滲養(yǎng)，氣血通行不暢，不能灌養(yǎng)玄府而致其功能衰退，正所謂“正虛之處，便是容邪之所”，與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中癡呆本虛標實的病機特點不謀而合。因此腦玄府功能郁閉為呆病發(fā)生的關(guān)鍵病理病機。

基于對VaD的病機認識，課題組認為，癡呆的治療之本則在于開通腦之玄府。而風藥是有效的一類開通藥物，取麻黃、葛根等藥物“風”的發(fā)散透暢、百變善行之性，載諸藥上行，上達頭之巔，主諸身之上下、內(nèi)外，鼓一身之氣血、轉(zhuǎn)運神機之用。因玄府自身功能的維持需氣血滲溉，故臣以補氣藥，促進臟腑功能，宣暢氣機，達補虛攻邪之功。氣血之運不通，久滯化瘀，瘀則成濁邪，故以蟲類藥配于組方中，走竄善消，散其瘀濁，助通玄府。玄府開闔有常，氣血流暢，神機自得以運化交轉(zhuǎn)。現(xiàn)代藥理研究顯示，方中石菖蒲、麻黃、葛根等“風藥”有效成分，可提高BDNF和NMDA受體表達，改善突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)[25-27]；黃芪中有效成分黃芪甲苷具有調(diào)節(jié)VaD模型大鼠MOD、白介素1和白介素6的表達，并有使海馬CA1區(qū)GluN1表達上調(diào)的作用[28]；人參皂苷Rb1可促進海馬CA3突觸核蛋白的表達，恢復(fù)CA3-Schaffer-CA1通路中的谷氨酸，進而增加突觸后密度-95 (PSD-95)的表達，從而調(diào)節(jié)記憶功能、突觸可塑性和興奮性傳遞[29]；蟲類藥水蛭、地龍對調(diào)節(jié)血液流變學、改善微循環(huán)具有一定作用[30-31]。且課題組前期研究顯示，風藥復(fù)方除改善VaD大鼠海馬突觸形態(tài)學[8]，還可通過減輕氧化應(yīng)激、保護線粒體[32-33]、維持中樞神經(jīng)遞質(zhì)平衡[34]、提高海馬神經(jīng)元cAMP、PKA表達并減輕凋亡(成果未發(fā)表)等途徑促進VaD大鼠學習記憶障礙的改善。

綜上所述，慢性腦灌注不足可以導致海馬神經(jīng)元突觸損傷，而pCREB、BDNF和GluN1、GluN2B及GluA2的表達與突觸結(jié)構(gòu)及傳遞效能密切相關(guān)。本研究顯示，在方中重用風藥麻黃、葛根寓以開通玄府的中藥復(fù)方，可顯著提高大鼠海馬神經(jīng)元pCREB、BDNF的表達，使海馬突觸興奮性氨基酸受體亞基GluN1、GluN2B和GluA2的蛋白表達增加，減輕缺血缺氧后海馬突觸的損傷，從而改善其學習和記憶障礙。同時，從本次實驗中給予的中藥治療劑量范疇可以得出，其劑量與療效具有正向依賴性。