原發(fā)性干燥綜合征患者淚液及唾液中細(xì)胞因子水平變化研究

陳 曄，王文婷，詹 峰

1.常州市腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 常州 213003；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院常州院區(qū) 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 常州 213003

原發(fā)性干燥綜合征是一種以女性多發(fā)的全身性風(fēng)濕性和自身免疫性疾病，其特征是多個(gè)部位的外分泌腺淋巴細(xì)胞浸潤，特別是唾液腺和淚腺[1]。臨床上，干燥綜合征可影響多個(gè)器官及系統(tǒng)，包括皮膚、呼吸道、泌尿生殖道和胃腸道中的外分泌腺，以及胰腺外器官受累[2]。當(dāng)淋巴細(xì)胞浸潤累及淚腺和唾液腺，可造成淚液和唾液分泌質(zhì)量改變、減少，最終導(dǎo)致干眼癥和口腔干燥癥。目前，原發(fā)性干燥綜合征導(dǎo)致的干眼癥和口腔干燥癥發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。此外，用于測定眼部和口腔體征的臨床工具通常易受主觀影響，且取決于醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)。而細(xì)胞因子分析檢測的優(yōu)點(diǎn)是不易產(chǎn)生主觀偏倚[3]。原發(fā)性干燥綜合征的組織學(xué)特征為單核細(xì)胞向外分泌腺的浸潤，CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞亞群、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞通過引發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致功能障礙并最終破壞外分泌腺[4]。盡管已有研究報(bào)道原發(fā)性干燥綜合征患者的細(xì)胞因子表達(dá)水平[5]，但未同時(shí)比較來自同一個(gè)體的淚液及唾液中的細(xì)胞因子水平。本研究分析同一隊(duì)列原發(fā)性干燥綜合征患者淚液及唾液中的細(xì)胞因子譜，旨在探討原發(fā)性干燥綜合征患者淚液及唾液中的細(xì)胞因子水平?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2015年6月至2019年6月于常州市腫瘤醫(yī)院就診的45例原發(fā)性干燥綜合征患者為研究對(duì)象，并將其納入B組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合原發(fā)性干燥綜合征國際分類標(biāo)準(zhǔn)[6]；女性。選取同期健康體檢者55例納入A組，均為女性，平均年齡(56.7±10.6)歲。B組患者平均年齡(51.0±13.8)歲。兩組研究對(duì)象年齡構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比行。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 Schirmer試紙?jiān)囼?yàn) 將Schirmer淚液試紙圓弧端夾于受試者眼瞼外三分之一處結(jié)膜囊內(nèi)，另一端懸掛于眼外，5 min后取下試紙，測量被淚液濕潤的長度并記錄，然后將試紙轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖液中，-80℃貯存。

1.2.2 靜態(tài)全唾液流率檢測 收集未刺激的全唾液以確定唾液分泌速率。采集唾液前，讓受試者以清水漱口，去除口腔內(nèi)食物殘?jiān)?，然后向無菌eppendorf管內(nèi)持續(xù)吐唾液，保持5 min。樣本以4℃、5 000 r/min離心20 min，取上清，將其等分，-80℃儲(chǔ)存。

1.2.3 淚液及唾液細(xì)胞因子水平分析 將儲(chǔ)存在磷酸鹽緩沖液中帶有Schirmer條帶的eppendorf管在冰上解凍，渦旋，并將105 μl樣品轉(zhuǎn)移到新管中。將唾液樣品以4℃、5 000 r/min離心5 min，將105 μl上清液轉(zhuǎn)移至新管中。然后以12 000 r/min、4℃離心10 min。部分上清液用于蛋白質(zhì)測量，并將等體積的磷酸鹽緩沖液/1.0%牛血清白蛋白加入剩余的樣品中。吸取所得磷酸鹽緩沖液/0.5%牛血清白蛋白懸浮液25 μl加入廣譜篩選試劑盒(Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay，貨號(hào)M50-0KCAF0Y)板上，檢測白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、IL-8、IL-17A、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1b(macrophage inflammatory protein 1b，MIP-1b)、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1a(macrophage inflammatory protein 1a，MIP-1a)等細(xì)胞因子。使用蛋白定量試劑盒(Pierce BCA Protein Assay Kit，Thermo Scientific)估算Schirmer條帶懸浮液和唾液中的總蛋白質(zhì)濃度。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象臨床干眼評(píng)估及口腔檢查結(jié)果比較 A組Schirmer試驗(yàn)濕潤長度為(21.0±6.7)mm，長于B組的(4.2±1.9)mm，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組靜態(tài)全唾液流率為(2.8±0.4)ml/min，高于B組的(0.9±0.3)ml/min，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 兩組研究對(duì)象淚液及唾液中細(xì)胞因子水平比較 B組淚液IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A、IFN-γ、MIP-1b、IP-10水平均顯著高于A組，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組唾液IP-10、MIP-1a水平均顯著高于A組，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組研究對(duì)象淚液及唾液中細(xì)胞因子水平比較(a.淚液中細(xì)胞因子水平；b.唾液中細(xì)胞因子水平)

2.3 Schirmer試驗(yàn)濕潤長度、靜態(tài)全唾液流率與細(xì)胞因子水平相關(guān)性分析 Schirmer試驗(yàn)濕潤長度與淚液中IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A、IFN-γ、MIP-1b水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.434、-0.528、-0.492、-0.463、-0.663、-0.604，P<0.05)。靜態(tài)全唾液流率與唾液中IP-10、MIP-1a水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.289、-0.289，P<0.05)。

3 討論

在唾液和淚液中發(fā)現(xiàn)分子及免疫生物標(biāo)志物有利于干燥綜合征患者的疾病診斷，并幫助建立靶向治療[7]。干眼癥是多因素造成的眼表面疾病，與眼表炎癥和損傷有關(guān)，特征為淚膜體內(nèi)平衡喪失[8]。本研究中，與A組比較，B組患者淚液中Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ，以及Th2型細(xì)胞因子IL-4水平均升高。既往研究表明，干燥綜合征患者常并發(fā)干眼癥，在眼結(jié)膜組織中可發(fā)現(xiàn)大量活化的CD4+T輔助細(xì)胞，提示T細(xì)胞歸巢進(jìn)一步促進(jìn)了結(jié)膜中的免疫激活[9]。此外，這些活化的CD4+T輔助細(xì)胞在眼結(jié)膜組織中分泌促炎細(xì)胞因子可能通過Th1和Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)造成眼表損傷。IFN-γ可由天然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌。有研究報(bào)道，IFN-γ水平升高與干燥綜合征相關(guān)，可與上皮組織相互作用產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[10-12]，還可以通過激活外源性凋亡在角膜上皮細(xì)胞凋亡和組織破壞中發(fā)揮重要作用[13]。IL-12主要由巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)IFN-γ產(chǎn)生和促進(jìn)Th1應(yīng)答中起重要作用。

本研究中，上調(diào)的IL-4主要參與Th2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和B細(xì)胞的活化，這些細(xì)胞因子在固有和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用，并提示患者疾病進(jìn)展。 本研究中，B組患者淚液中MIP-1b和IL-8水平顯著升高。MIP-1b和IL-8可以吸引Th1細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表達(dá)特定受體(如CCR5和CXCR3)的樹突細(xì)胞到角膜和結(jié)膜組織[14]。有研究表明，干眼癥患者淚液中MIP-1b水平顯著增加[15]。此外，IL-8對(duì)T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化作用。因此，T淋巴細(xì)胞的這種大量浸潤和活化可能通過細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致淚腺和眼表組織損傷。

本研究中，B組患者唾液IP-10、MIP-1a水平升高，且與靜態(tài)全唾液流率相關(guān)。原發(fā)性干燥綜合征對(duì)牙周疾病有負(fù)面影響[16]，IP-10參與了干燥綜合征患者唾液腺中T細(xì)胞浸潤的累積[17]，牙周病患者唾液中MIP-1a水平更高[18]。本研究中，B組患者淚液中抗炎細(xì)胞因子IL-17水平增加。有研究在干燥綜合征患者的唾液腺和血清中檢測到IL-17，證實(shí)其與干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[19]。此外，IL-17還可能在干眼病的角膜上皮屏障破壞中發(fā)揮作用。

綜上所述，原發(fā)性干燥綜合征患者淚液及唾液中細(xì)胞因子水平顯著升高，且與淚液生成減少、唾液流率減緩顯著相關(guān)，從而參與影響眼干、口干的臨床癥狀。