束縛應(yīng)激對妊娠期大鼠海馬突觸可塑性的影響*

白華毅，劉婷婷，鄧卓凡，何成蕓，宋春蓮，程美玲

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)系，云南 昆明 650201)

隨著女性社會地位的變化，妊娠期內(nèi)女性需要面對來自工作、人際交往及家庭生活中各種應(yīng)激事件，如工作壓力、過度焦慮和家庭矛盾等，由此導(dǎo)致的精神疾病如產(chǎn)前抑郁癥等發(fā)病率不斷增高。據(jù)報道，國內(nèi)產(chǎn)前抑郁癥的發(fā)病率高達4.36%～30.79%[1]，并且每年以9%的速率上升[2]，妊娠期精神疾病的研究受到越來越多國內(nèi)外研究的重視。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：妊娠期內(nèi)應(yīng)激使得圍生期抑郁癥的易感性增加[3]。也有文獻表明：妊娠期內(nèi)應(yīng)激誘導(dǎo)子代大鼠的抑郁樣行為并對其認知功能造成損害[4-5]，因而妊娠期內(nèi)應(yīng)激對母代及子代的身心發(fā)育都有不良影響。因此，近年來妊娠期應(yīng)激誘發(fā)的精神疾病及其機制研究受到越來越多的關(guān)注。目前已有報道表明：長期慢性的應(yīng)激會對海馬造成損害，包括其興奮性以及神經(jīng)元形態(tài)，嚴重的會導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，最終影響海馬的功能[6-7]。如NIFOSI 等[8]發(fā)現(xiàn)：抑郁癥患者的大腦海馬體積較正常人明顯減??；KOLBER等[9]的研究表明：急性應(yīng)激可提高身體和精神反應(yīng)，但長期應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致一系列負面效應(yīng)，包括損害海馬所依賴的認知。突觸可塑性包括長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)，被公認為是學(xué)習(xí)、記憶和情緒等細胞水平的生物學(xué)基礎(chǔ)。而最近一些研究表明：多種精神疾病的發(fā)病起因可能與最早發(fā)生的突觸可塑性的變化有關(guān)，突觸可塑性的改變可能是引起后續(xù)神經(jīng)可塑性變化、細胞衰亡和海馬萎縮的起因[10-11]。推測妊娠期應(yīng)激相關(guān)精神疾病的發(fā)生可能與妊娠期內(nèi)應(yīng)激誘發(fā)的海馬突觸可塑性變化有關(guān)。目前針對應(yīng)激對妊娠期內(nèi)大鼠海馬突觸可塑性影響的研究尚未見報道。因此，本研究對妊娠期大鼠施行慢性束縛應(yīng)激，通過經(jīng)典的人工低頻電刺激誘導(dǎo)方案，檢測海馬突觸可塑性長時程抑制(LTD)的改變，為妊娠期精神疾病的發(fā)病機制提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SD 雌性大鼠(昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量250～280 g，動物單獨飼養(yǎng)，12 h/12 h明暗交替，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24 ℃，相對濕度40%～66%，任其自由采食與飲水。

1.2 試驗材料

20%氨基甲酸乙酯(天津市光復(fù)精細化工研究所)，鹽酸普魯卡因(新鄉(xiāng)市長樂制藥有限責(zé)任公司)，顱骨打孔機(自制)，數(shù)顯腦立體定位儀(安徽正華生物儀器有限公司)，自制電極(2 根擰在一起的鉑銥合金電極絲，外部絕緣層為聚酰亞胺，內(nèi)徑50 μm，外徑75 μm)，生物信號采集器(Powerlab 4/35 AD Instruments，澳大利亞)，生物信號放大器(DP-311 Differential Amplifire，Warner Instrument，美國)，刺激隔離器(ISO-flex，A.M.P.I.，以色列)。

1.3 妊娠后慢性束縛應(yīng)激

束縛應(yīng)激是一種經(jīng)典的長時慢性應(yīng)激方案，能較好模擬人類孕期某些活動少、缺少自由、空間狹小等慢性應(yīng)激的情況。實施方案參照CHIBA等[12]和NAERT 等[13]的研究，具體如下：將雌鼠與雄鼠合籠后于次日清晨檢查雌鼠陰道口有無陰栓，將檢查到陰栓的雌鼠記為妊娠期0 d，而后將妊娠期5 d 的大鼠每天置于束縛筒內(nèi)，保持大鼠僅能呼吸運動，每天2 h，連續(xù)15 d，束縛應(yīng)激結(jié)束后放回飼養(yǎng)籠。

1.4 電生理試驗

1.4.1 手術(shù)

束縛應(yīng)激結(jié)束后24 h，用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉大鼠后，進行顱骨暴露手術(shù)。固定在立體腦定位儀后通過顱骨開孔將記錄電極植入海馬CA1 區(qū)輻射層(開孔位置為前囪后3.8 mm，中縫旁2.8 mm)，刺激電極植入位置為海馬Schaffer 側(cè)枝(開孔位置為前囪后4.8 mm，中縫旁3.8 mm)。

1.4.2 電極植入及記錄興奮性突觸后膜電位

將記錄電極和刺激電極緩慢同步植入(所給刺激量為4 V，1 ms 刺激方波)，2 根電極植入的深度根據(jù)記錄電極所記錄到的興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)(30 s 記錄1 次)達到最大、穩(wěn)定不再變化，并符合峰值潛伏期(peak latency，通常為10～15 ms)來決定[14]。當(dāng)滿足所有條件后，繼續(xù)記錄10 min，若波形及幅值穩(wěn)定，則進行下一步操作。

1.4.3 海馬突觸可塑性檢測

為尋求最適刺激量，將所給刺激量依2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 和5.5 V 的梯度進行測試，給予1 ms 刺激方波，記錄fEPSP，取fEPSP最大峰值的50%～60%所對應(yīng)的刺激量為最適刺激量。并穩(wěn)定記錄興奮性突觸后膜電位60 min(30 s 記錄1 次)，未超過5%的變化后再進行下一步低頻誘導(dǎo)[14]。采用經(jīng)典低頻刺激誘導(dǎo)方案[15](1 Hz，900 pulse)進行誘導(dǎo)。而后刺激量采用測試出的最適刺激量，其他參數(shù)均不變，穩(wěn)定記錄興奮性突觸后膜電位60 min (30 s 記錄1 次)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

在體電生理試驗中，取Powerlab 軟件記錄到的fEPSP 幅值，把低頻誘導(dǎo)(low-frequency stimulate，LFS)后記錄到的最后10 min fEPSP 幅值和誘導(dǎo)前記錄的fEPSP 的幅值進行統(tǒng)計處理，如果有顯著性差異就判定誘導(dǎo)出LTD。試驗結(jié)果以O(shè)rigin 9.1 做圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。用單因素方差分析或者Student’sttest 進行統(tǒng)計處理(SPSS 24)。

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠期大鼠海馬突觸可塑性的變化

結(jié)果顯示：妊娠大鼠的突觸可塑性發(fā)生顯著改變。采用1 Hz 的低頻誘導(dǎo)方案進行誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)前后，空白對照組(CTL)大鼠與妊娠組(PRE)大鼠的fEPSP 波形變化示例見圖1a。統(tǒng)計結(jié)果顯示：空白對照組(CTL)大鼠誘導(dǎo)后的fEPSP 值(98.68%±3.64%)與自身基線(101.36%±2.72%)比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05，圖1b)。而未施行束縛應(yīng)激的妊娠組(PRE)大鼠，誘導(dǎo)前后fEPSP 值的變化見圖1b，誘導(dǎo)后(112.64%±4.99%)與自身基線(99.54%±3.94%)比較海馬興奮性突觸后電位明顯增大，有極顯著差異(P＜0.01，圖1b)，形成長時程增強(LTP)。

圖1 妊娠后低頻刺激誘導(dǎo)出LTPFig.1 LTP induced by low frequency stimulation after pregnancy

2.2 妊娠期慢性束縛應(yīng)激對海馬突觸可塑性的影響

研究結(jié)果表明：妊娠期應(yīng)激會對海馬突觸可塑性造成影響。將未妊娠應(yīng)激組(STR)大鼠經(jīng)過束縛應(yīng)激之后，其fEPSP 誘導(dǎo)前后波形示例如圖2a 所示，誘導(dǎo)前后變化見圖2b，誘導(dǎo)后的fEPSP 值(87.45%±1.85%)與自身基線(96.52%±2.67%)相比，統(tǒng)計學(xué)差異極顯著(P＜0.01，圖2b)，形成長時程抑制(LTD)。而經(jīng)過束縛應(yīng)激的妊娠應(yīng)激組(P+S)大鼠誘導(dǎo)前后波形示例如圖2a 所示，誘導(dǎo)后fEPSP 值(103.73%±3.86%)與自身基線(101.78%±1.09%)比較海馬興奮性突觸后電位無顯著差異(P＞0.05，圖2b)。

2.3 4 組大鼠海馬突觸可塑性變化情況比較

圖2 妊娠后應(yīng)激未誘導(dǎo)出LTDFig.2 Post-pregnancy stress did not induce LTD

圖3 低頻誘導(dǎo)前后4 組大鼠海馬突觸可塑性的比較Fig.3 Comparison of synaptic plasticity in hippocampus before and after low frequency induction in four groups of rats

分別統(tǒng)計4 組大鼠在低頻誘導(dǎo)前后的fEPSP幅值，誘導(dǎo)前4 組之間的基線無顯著差異(P＞0.05，圖3a)，即可將4 組在誘導(dǎo)前基線水平視作100%。而經(jīng)過低頻誘導(dǎo)后，4 組間的對比見圖3b，將對照組(CTL：8.68%±3.64%)與妊娠組(PRE：112.64%±4.99%)相比，誘導(dǎo)后fEPSP 值有極顯著性差異(P＜0.01，ANOVA)；而應(yīng)激組(STR：87.45%±1.85%)與妊娠應(yīng)激組(P+S：103.73%±3.86%)相比，誘導(dǎo)后fEPSP 值具有極顯著性差異(P＜0.01，ANOVA)。除此之外，本研究還比較了對照組(CTL)與應(yīng)激組(STR)的差異，兩組誘導(dǎo)后fEPSP 值有極顯著性差異(P＜0.01，ANOVA)，而應(yīng)激組(PRE)與妊娠應(yīng)激組(P+S)相比，誘導(dǎo)后最后10 min fEPSP 值具有極顯著性差異(P＜0.01,ANOVA)。

3 討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)是低頻電刺激在妊娠大鼠上誘導(dǎo)出長時程增強(LTP)，但在施行慢性束縛應(yīng)激后的妊娠大鼠上，未誘導(dǎo)出長時程增強(LTP)和長時程抑制(LTD)。

首先，本研究所用1 Hz 頻率的低頻刺激，在未妊娠的空白對照大鼠上不能誘導(dǎo)出LTP 或LTD，卻在未妊娠組大鼠上誘導(dǎo)出顯著的LTP，表明妊娠后大鼠海馬突觸可塑性發(fā)生了變化。1 Hz 的誘導(dǎo)方案是目前國內(nèi)外公認的誘導(dǎo)LTD 經(jīng)典方案，在未應(yīng)激情況下，不能誘導(dǎo)出LTD[16]，而結(jié)果顯示：這種1 Hz 誘導(dǎo)方案在妊娠期大鼠上誘導(dǎo)出長時程增強(LTP)。一般來說，人工誘發(fā)形成LTP 需要200 Hz 左右的高頻率刺激，使位于突觸后膜上的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methy-D-aspartate receptor，NMDAr)打開，繼而引發(fā)一系列包括CaMKⅡ[17]、PKC[18]、cAMP以及ERK/MAPK[19]等胞內(nèi)信號的變化，才能誘導(dǎo)出LTP。因此，推測在妊娠期大鼠上1 Hz 的低頻刺激就可誘發(fā)出LTP 的原因可能是妊娠后大鼠的內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生了劇烈變化，如妊娠后雌激素和孕激素分泌增多，促使海馬突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達發(fā)生變化，進而影響海馬突觸可塑性。而早期在分子和細胞水平的研究發(fā)現(xiàn)：雌激素可增強NMDA 通道活性及LTP[20-21]。而后許多研究表明：雌激素參與調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性的NMDAR的表達，并且可通過Src 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強NMDA 受體亞基NR2B 的磷酸化[22-23]，磷酸化后可促進LTP 的形成。更有研究發(fā)現(xiàn)：雌性大鼠動情前期(雌激素水平最高)海馬CA1 區(qū)fEPSP 斜率及LTP 增強程度明顯高于其他期[24]。因此，本研究提示了妊娠期內(nèi)激素對海馬突觸可塑性的調(diào)節(jié)有明顯作用。

已有研究表明：海馬對于應(yīng)激較為敏感，應(yīng)激后1 Hz 的低頻率刺激可誘導(dǎo)出顯著的LTD[25]。在本研究中，作為對照的未妊娠鼠應(yīng)激后，低頻刺激可誘導(dǎo)出顯著的LTD，這與之前XU 等[25]的有關(guān)應(yīng)激易化LTD 的研究一致。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：妊娠后經(jīng)過應(yīng)激的大鼠，低頻刺激卻未誘導(dǎo)出LTD，說明應(yīng)激使妊娠大鼠的海馬突觸可塑性發(fā)生異常變化，而突觸可塑性與NMDAR 亞型的表達，與PKA 和cAMP 等信號分子有關(guān)。雌激素與雌激素受體結(jié)合后可增加胞內(nèi)PKA 和cAMP活性，使Ca2+通道磷酸化，Ca2+內(nèi)流，突觸可塑性增強[26]。也可通過調(diào)節(jié)NMDAR 亞基NR2B 的磷酸化[22-23]，促進LTP 的形成。而應(yīng)激后，大鼠的下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitaryadrenocortical axis，HPA)激活，使機體內(nèi)的腎上腺皮質(zhì)激素水平大幅度增高[27]。腎上腺皮質(zhì)激素又可通過影響NMDAR 亞基及相關(guān)信號分子，影響海馬突觸可塑性[28]。還有研究表明：腎上腺皮質(zhì)激素可使海馬CA1 區(qū)雌激素受體表達下降[29]。因此，推測其原因可能是雌激素與應(yīng)激所介導(dǎo)的分子信號產(chǎn)生了相互作用，進而影響了海馬突觸可塑性，其具體機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

妊娠后大鼠海馬突觸可塑性增強，妊娠期內(nèi)慢性應(yīng)激可損傷單向海馬突觸可塑性。本研究為妊娠期應(yīng)激相關(guān)精神疾病的發(fā)病機制研究提供了重要的神經(jīng)電生理學(xué)依據(jù)。