歐美楊PdMODD基因克隆與表達(dá)特性分析

張騰倩，張偉溪，丁昌俊，張 靜，胡贊民，蘇曉華*

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101)

近年來(lái)，隨著RNAi、基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄抑制因子基因挖掘已成為基因工程育種研究的熱點(diǎn)之一。迄今為止，在植物中鑒定的最具代表性的轉(zhuǎn)錄抑制基序?yàn)镋AR(ethylene-responsive element binding factor-associated amphiphilic repression)基序，其包含一段保守序列LxLxL或DLNxxP，廣泛存在于各種轉(zhuǎn)錄抑制因子中[1]。EAR基序介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制被認(rèn)為是與轉(zhuǎn)錄激活并存且極為重要的一種基因調(diào)節(jié)機(jī)制，研究表明，含有EAR基序的蛋白可以通過(guò)負(fù)調(diào)控基因表達(dá)在植物器官發(fā)育、激素應(yīng)答、抗病反應(yīng)及干旱脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮重要的作用[2]。

MODD(mediator of OsbZIP46 deactivation and degradation)是由Tang等[3]首次在水稻(Oryzasativa)中鑒定的具有典型EAR基序的轉(zhuǎn)錄抑制因子，屬于NINJA(novel interactor of JAZ)家族蛋白。NINJA家族蛋白序列一致性高，都含有A、B、C等3個(gè)保守區(qū)域，其中A保守區(qū)域?yàn)镋AR基序，該基序是NINJA家族蛋白與協(xié)同抑制因子TPL(TOPLESS)和TPRs(TPL-related proteins)的互作位點(diǎn)；B區(qū)域含有一段核定位信號(hào)序列；C區(qū)域?yàn)镹INJA蛋白與JAZ(jasmonate zim-domain)互作的位點(diǎn)[4-7]。

研究表明，水稻MODD基因在ABA信號(hào)傳導(dǎo)和干旱脅迫應(yīng)答中具有負(fù)調(diào)控作用[3]：干旱脅迫下，MODD過(guò)表達(dá)株系的存活率顯著低于野生型，而突變株系增加了對(duì)ABA的敏感性和抗旱性；MODD可通過(guò)EAR基序結(jié)合OsTPR3蛋白招募表觀調(diào)控因子HDA702抑制OsbZIP46(ABA信號(hào)傳導(dǎo)正調(diào)控因子)活性，通過(guò)OsPUB70介導(dǎo)的泛素化抑制OsbZIP46穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)水稻ABA信號(hào)傳導(dǎo)和抗旱性[3,8]。此外，MODD還能與水稻中其他干旱正調(diào)控因子OsbZIP23[9]和OsbZIP72[10]相互作用。但是目前關(guān)于MODD基因在木本植物中的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

‘渤豐3號(hào)’楊(Populus×euramaricana‘Bofeng 3 hao’)，雌株，屬歐美楊，是中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所自主培育的短輪伐期速生優(yōu)良品種，已通過(guò)國(guó)家林木良種審定，具有速生、適應(yīng)性強(qiáng)等特性，適于遼寧、山東、河南等地生長(zhǎng)。我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)面積廣闊，生態(tài)環(huán)境惡劣，鹽堿地總面積達(dá)9 900萬(wàn)hm2[11]，因此挖掘林木抗逆脅迫相關(guān)基因具有重要意義。本研究基于水稻MODD氨基酸序列,通過(guò)同源比對(duì)的方法在歐美楊中得到3條PdMODD基因，并對(duì)其序列特征、親緣進(jìn)化關(guān)系、組織特異性及NaCl和聚乙二醇(PEG)脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究楊樹(shù)MODD基因功能提供理論依據(jù)，并為培育優(yōu)良抗逆楊樹(shù)新品種提供候選基因資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理方法

供試材料為中國(guó)林科院林業(yè)研究所楊樹(shù)課題組自主選育的優(yōu)良新品種‘渤豐3號(hào)’楊。將生長(zhǎng)40 d的組培苗煉苗后置于光照時(shí)間為16 h、平均溫度25 ℃、相對(duì)濕度70%～80% 的溫室內(nèi)進(jìn)行水培，培養(yǎng)液為1/10 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)1周后選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的‘渤豐3號(hào)’楊，分別用含有200 mmol/L NaCl和質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%聚乙二醇(PEG6000)的培養(yǎng)液進(jìn)行處理，同時(shí)設(shè)以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的對(duì)照，在處理0、3、6、12、24、48 h時(shí)進(jìn)行根、莖、葉組織的取材，材料用液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每個(gè)處理至少3株，3次重復(fù)。

1.2 PdMODD基因的克隆與序列分析

基于水稻MODD氨基酸序列，以美洲黑楊(PopulusdeltoidesWV94v2.1)為參考基因組，利用JGI(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!search?show=BLAST)進(jìn)行BLAST，篩選出同源性較高(期望值<1×10-10)的3條基因Podel.08G114100、Podel.10G158900和Podel.17G098500，分別以3條基因的CDS序列為參考設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。以‘渤豐3號(hào)’楊cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的基因序列分別命名為PdMODD1、PdMODD2和PdMODD3(GenBank登錄號(hào)：MW255958、MW255959、MW255960)。其中PCR反應(yīng)體系為：PCR Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，去離子水6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),回收純化后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α,挑取陽(yáng)性單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。

表1 研究設(shè)計(jì)的引物序列Table 1 Primer sequences related in this study

利用NCBI中CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)PdMODD蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域。用ProtParam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)計(jì)算推導(dǎo)PdMODD基因所編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、理化等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和親水性平均系數(shù)。用Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預(yù)測(cè)PdMODD蛋白的亞細(xì)胞定位。利用BioEdit對(duì)PdMODD的同源蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)；通過(guò)MEGA 5.05 軟件使用Neighbor-Joining(NJ)法對(duì)PdMODD及其同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 亞細(xì)胞定位分析

利用BioEdit 軟件分別對(duì)目的基因PdMODD1、PdMODD2、PdMODD3 CDS序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，結(jié)合pBI121-GFP載體(由花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))，選用SmaI作為酶切位點(diǎn)，根據(jù)同源融合的方法設(shè)計(jì)特異性引物，即在引物兩端插入pBI121-GFP載體SmaI酶切位點(diǎn)兩端的同源序列(表1)。以測(cè)序正確的pMD18-T-PdMODD質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Seamless Assembly Cloning Kit(clone smarter，USA)連接目的片段與線性pBI121-GFP載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，測(cè)序驗(yàn)證pBI121-PdMODD-GFP融合表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。

通過(guò)基因槍轟擊法[12]分別將構(gòu)建好的pBI121-PdMODD-GFP融合表達(dá)載體轟擊到在MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)12 h的洋蔥(Alliumcepa)表皮細(xì)胞中，暗培養(yǎng)24 h 后在激光共聚焦顯微鏡(model LSM410，Zeiss，Jena，Germany)下進(jìn)行觀察和拍照，空載pBI121-GFP作為對(duì)照。

1.4 鹽和干旱脅迫下PdMODD基因表達(dá)分析方法

采用RNAprep Pure Plant Plus Kit(TIANGEN BIOTECH，Beijing，China)提取‘渤豐3號(hào)’楊不同組織總RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，Japan)將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍用作qRT-PCR模板。肌動(dòng)蛋白(actin)為內(nèi)參基因，所用引物序列見(jiàn)表1。

使用LightCycler? 480熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR，其反應(yīng)體系為：2×TB GreenPremixExTaqII(Tli RNaseH Plus)10 μL(TaKaRa，Japan)，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，模板2 μL，去離子水6.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；80 ℃ 1 s。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，每個(gè)樣品重復(fù)3次。將qRT-PCR獲得的結(jié)果使用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[13-14]，采用SPSS 19.0單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdMODD基因的克隆與序列分析

圖1 ‘渤豐3號(hào)’楊PdMODD基因的克隆Fig.1 Cloning of PdMODD genes from P.euramaricina ‘Bofeng 3 hao’

以‘渤豐3號(hào)’楊cDNA為模板，以在美洲黑楊基因組中篩選的3條基因(Podel.08G114100、Podel.10G158900和Podel.17G098500)CDS序列為參考設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到3條基因，分別命名為PdMODD1～3，擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。膠回收產(chǎn)物純化后連接pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，將菌液PCR檢測(cè)得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序獲得的PdMODD1～3基因序列與美洲黑楊基因組中對(duì)應(yīng)的序列相似度很高，分別為97%、99%和99%。

對(duì)PdMODD基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PdMODD1～3的開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度分別為1 065、1 065和1 074 bp，分別編碼354、354和357個(gè)氨基酸(表2)。理化性質(zhì)分析顯示，PdMODD分子質(zhì)量分別為38.83、38.71和39.56 ku，理論等電點(diǎn)為7.66、8.20和6.05，不穩(wěn)定系數(shù)為60.31、64.18和64.12，親水性平均系數(shù)為-0.847、-0.873和-0.775，均為不穩(wěn)定的親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)推斷3條PdMODD基因編碼產(chǎn)物均定位于細(xì)胞核。

表2 PdMODD基因特性分析Table 2 Sequence feature analysis of PdMODD

2.2 PdMODD蛋白保守結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化樹(shù)分析

利用NCBI中CD-search分析PdMODD蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明PdMODD蛋白均含有EAR、NINJA_B和 Jas保守結(jié)構(gòu)域，屬于NINJA家族。通過(guò)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PdMODD與NINJA家族AFP蛋白同源性較高，選擇相似度較高的毛果楊(Populustrichocarpa)、麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)、木薯(Manihotesculenta)等6種植物AFP氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，PdMODD與其他6種植物AFP氨基酸序列長(zhǎng)度相近且相對(duì)保守，均具有NINJA家族所特有的3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N-端高度保守的LxLxL型EAR基序，139～177位相對(duì)保守的NINJA_B結(jié)構(gòu)域及C-端Jas結(jié)構(gòu)域(圖2)。

為了進(jìn)一步研究PdMODD與其他AFP蛋白的親緣關(guān)系，利用MEGA 5.05軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果(圖3)顯示，PdMODD1與毛果楊PtAFP2親緣關(guān)系最近，并與擬南芥AtAFP1、木薯MeAFP2聚成一個(gè)分支；PdMODD2與麻瘋樹(shù)JcAFP2親緣關(guān)系最近，與擬南芥AtAFP2位于一個(gè)分支；PdMODD3與毛果楊PtAFP3-1親緣關(guān)系最近，與栓皮櫧QsAFP3、擬南芥AtAFP4聚于同一分支。

PtAFP2，PtAFP3-1，PtAFP3-2.毛果楊(Populus trichocarpa)；JcAFP2.麻瘋樹(shù)(Jatropha curcas)；PpAFP3.碧桃(Prunus persica)；MeAFP2.木薯(Manihot esculenta)；QsAFP3.栓皮櫧(Quercus suber)；AT1G69260,AtAFP2,AtAFP3,AtAFP4：擬南芥AtAFP1。下同。The same below.圖2 PdMODD與其他植物AFP氨基酸序列多重比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of PdMODD with other plant AFP amino acid sequences

圖3 PdMODD與其他植物AFP蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of PdMODD and other plant AFP proteins

2.3 PdMODD基因亞細(xì)胞定位與組織特異性分析

GFP.熒光場(chǎng)fluorescence field；Bright.明場(chǎng)bright field；Merged.疊加場(chǎng)superposition field of fluorescence field and bright field；35S::GFP.GFP空載體empty carrier；35S::PdMODD-GFP.帶有目的基因PdMODD與GFP的融合表達(dá)載體fusion expression vector containing target gene PdMODD and GFP。圖4 PdMODD在洋蔥表皮中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of pBI121-PdMODD-GFP in onion epidermal cells

為了研究PdMODD的亞細(xì)胞定位，將PdMODD基因與GFP綠色熒光蛋白基因融合后構(gòu)建植物融合表達(dá)載體pBI121-PdMODD-GFP，通過(guò)基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，分別將pBI121-PdMODD-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)24 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察PdMODD基因的定位情況。結(jié)果顯示(圖4)，對(duì)照pBI121-GFP(35S::GFP)在細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)都有綠色熒光分布，PdMODD1、PdMODD2、PdMODD3只在細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光分布，說(shuō)明PdMODD1～3均定位在細(xì)胞核中，與預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

通過(guò)qRT-PCR分析正常生長(zhǎng)條件下PdMODD基因在‘渤豐3號(hào)’楊不同組織的表達(dá)模式，結(jié)果顯示PdMODD1、PdMODD2和PdMODD3的表達(dá)模式相似，均在葉中表達(dá)量最高，莖中次之，根中表達(dá)量最低，其中PdMODD1和PdMODD3在莖和葉中的表達(dá)量均顯著高于根中(圖5)，表明PdMODD基因在不同組織間的表達(dá)存在差異，具有組織特異性。

x.相對(duì)表達(dá)量relative expression level;*.P <0.05.圖5 ‘渤豐3號(hào)’楊PdMODD基因的組織特異性表達(dá)Fig.5 The relative expression of PdMODD in different organizations

2.4 PdMODD基因?qū)}和干旱脅迫的響應(yīng)

在NaCl和PEG處理?xiàng)l件下，3 h時(shí)‘渤豐3號(hào)’楊頂端葉片開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫下垂，隨著脅迫時(shí)間的推移，葉片萎蔫程度逐漸加重，48 h時(shí)萎蔫現(xiàn)象最明顯。為了探究PdMODD基因與鹽和干旱脅迫的應(yīng)答關(guān)系，采用qRT-PCR分析了NaCl和PEG處理下3個(gè)基因在根、莖、葉器官的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，NaCl脅迫下，根中PdMODD1、PdMODD2 和PdMODD3的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，在3～24 h的表達(dá)量均極顯著高于0 h(CK)，其中PdMODD3表達(dá)量最高，在3、6、12、24 h的表達(dá)量分別高達(dá)對(duì)照的398.51、454.57、375.30、314.19倍。在莖中，PdMODD1～3基因均被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，隨著脅迫時(shí)間增長(zhǎng)表達(dá)趨勢(shì)近似于“N”形，表達(dá)量均在6 h升高至峰值，分別為對(duì)照的38.54、41.46和139.50倍。在葉中，3個(gè)基因的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照，且表達(dá)趨勢(shì)隨脅迫時(shí)間增長(zhǎng)呈倒“V”形，均在6 h出現(xiàn)峰值，表達(dá)量分別為對(duì)照的21.42、16.92、140.31倍(圖6A、6B、6C)。以上結(jié)果表明，PdMODD1、PdMODD2 和PdMODD3基因均能對(duì)鹽脅迫做出應(yīng)答。

對(duì)照0 h的數(shù)值均為0。The value at 0 h treatment is 0.x.相對(duì)表達(dá)量relative expression level。*和**分別表示相對(duì)于0 h在P<0.05和P <0.01水平上表達(dá)差異顯著。* and ** means the significant difference comparing with 0 h at P <0.05 and P <0.01 level.圖6 PdMODD基因在NaCl和PEG脅迫下的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of PdMODD genes under NaCl and PEG stress

PEG脅迫下，根中PdMODD1、PdMODD2 和PdMODD3在所有脅迫時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著高于0 h，且3個(gè)基因表達(dá)趨勢(shì)大致相同，近似于倒“V”形，其中PdMODD1和PdMODD2在6 h表達(dá)量最高，分別是對(duì)照的25.16和15.70倍；PdMODD3在3 h達(dá)峰值，為對(duì)照的353.22倍。在莖中，PdMODD1和PdMODD2在大部分脅迫時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生顯著變化，而PdMODD3在整個(gè)脅迫過(guò)程中均顯著上調(diào)表達(dá)；在葉中，除PdMODD2在48 h的表達(dá)外，3個(gè)基因均極顯著高于對(duì)照，其中PdMODD1和PdMODD2表達(dá)模式基本一致，在6 h表達(dá)量最高，分別為對(duì)照的37.646和23.56倍，PdMODD3在3 h最高，是對(duì)照的181.11倍(圖6D、6E、6F)。結(jié)果表明PdMODD1、PdMODD2 和PdMODD3可能參與了‘渤豐3號(hào)’楊干旱脅迫應(yīng)答。

3 討 論

已有研究表明，含有EAR基序的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑在植物防御和逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1-2,15-16]。如調(diào)控植物的抗病反應(yīng)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)NIMIN1增強(qiáng)了植株對(duì)病原體的敏感性[17]；過(guò)表達(dá)NRR降低了水稻植株對(duì)病原體的抗性[18]。調(diào)節(jié)植物的鹽和干旱脅迫響應(yīng)，如過(guò)量表達(dá)AtERF4導(dǎo)致擬南芥對(duì)干旱更為敏感[19]。最近有研究表明AtERF4還可以負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的鐵缺乏反應(yīng)[20]；在水稻中過(guò)表達(dá)OsAP2-39基因，增加了植株對(duì)干旱的敏感性，導(dǎo)致種子數(shù)和生物量的下降[21]；過(guò)表達(dá)OsDERF1降低了水稻植株對(duì)干旱的耐受性，而敲除OsDERF1的水稻對(duì)干旱耐受性增強(qiáng)[22]。突變水稻OsERF3基因的EAR基序，植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱性[23]。缺失EAR基序的SlERF3(SlERF3ΔRD)在番茄(Solanumlycopersicum)中過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了PR1、PR2、PR5等致病相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，增強(qiáng)了番茄對(duì)青枯病的耐受性。此外，在擬南芥和番茄中過(guò)表達(dá)SlERF3ΔRD可增強(qiáng)植物的耐鹽性[24]。缺失EAR基序的鋅指蛋白ZFP182在煙草和水稻中的過(guò)表達(dá)均可提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[25]。通過(guò)對(duì)PdMODD氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)PdMODD具有保守的EAR基序，因此初步推測(cè)PdMODD基因可能會(huì)在歐美楊逆境脅迫中起重要的調(diào)節(jié)作用。

PdMODD基因均定位于細(xì)胞核，與擬南芥[26]、小麥[27]、唐菖蒲[28]AFP基因相同，表明其可能會(huì)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在細(xì)胞核中行使功能。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)進(jìn)一步研究顯示PdMODD1蛋白與PtAFP2親緣關(guān)系最近，并與AtAFP1、MeAFP2聚成一個(gè)分支，其中GJI數(shù)據(jù)庫(kù)中功能注釋信息顯示PtAFP2和MeAFP2能參與植物的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，AtAFP1可負(fù)向調(diào)控ABA應(yīng)答[4]；PdMODD2蛋白與AtAFP2位于一個(gè)分支，研究發(fā)現(xiàn)AtAFP2與AtAFP1相同，均能通過(guò)EAR結(jié)構(gòu)域與TPL蛋白互作進(jìn)而介導(dǎo)ABI5(ABA-insensitive 5)的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)ABA應(yīng)答，此外AtAFP1或AtAFP2的突變可導(dǎo)致植株對(duì)ABA和鹽敏感性增加[4,26]；PdMODD3與PtAFP3-1親緣關(guān)系最近，并與AtAFP4聚于同一分支，其中PtAFP3-1被預(yù)測(cè)可參與轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，AtAFP4蛋白被報(bào)道在細(xì)胞核中起作用，是ABA和鹽脅迫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)劑[29]。研究表明ABA是植物參與脅迫響應(yīng)的重要激素,可提高植物抗旱耐鹽性[30]，因此，綜合以上結(jié)果進(jìn)一步推測(cè)PdMODD可能在楊樹(shù)逆境脅迫中起重要的調(diào)節(jié)作用。

為探究‘渤豐3號(hào)’楊PdMODD基因在鹽和干旱脅迫下的響應(yīng)模式，利用qRT-PCR技術(shù)分析了NaCl和PEG處理下3個(gè)PdMODD基因的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，在兩種脅迫下PdMODD1～3在根、莖、葉中主要為顯著上調(diào)表達(dá)模式，說(shuō)明PdMODD1～3能被NaCl和PEG脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這與擬南芥AFP[4]和水稻MODD[3]基因在鹽和干旱脅迫下的表達(dá)模式有一定的相似性，推測(cè)PdMODD1～3參與了‘渤豐3號(hào)’楊鹽和干旱脅迫應(yīng)答。

綜上所述，PdMODD1～3為NINJA家族成員，含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)為轉(zhuǎn)錄抑制基序EAR，定位于細(xì)胞核；3個(gè)基因均具有組織特異性，在葉中表達(dá)量最高，均能被NaCl和PEG脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且分別與ABA響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子AtAFP1、AtAFP2和AtAFP4位于一個(gè)分支，由此推測(cè)PdMODD1、PdMODD2 和PdMODD3可能會(huì)在‘渤豐3號(hào)’楊對(duì)鹽和干旱脅迫的響應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。但3個(gè)基因是否會(huì)同水稻MODD功能一樣，即作為負(fù)調(diào)控因子參與歐美楊鹽和干旱脅迫響應(yīng)，還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。在后續(xù)研究中筆者將繼續(xù)對(duì)PdMODD基因在‘渤豐3號(hào)’楊抗逆過(guò)程中的具體功能和作用機(jī)制進(jìn)行分析，為進(jìn)一步揭示楊樹(shù)抗逆分子機(jī)制、培育優(yōu)良抗逆楊樹(shù)新品種提供理論依據(jù)與候選基因資源。