33個(gè)楊柳品種指紋圖譜構(gòu)建

何旭東，鄭紀(jì)偉，孫 沖，何開(kāi)躍，王保松*

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153;2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)柳樹(shù)資源圃，江蘇 南京 211153;3.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

楊樹(shù)與柳樹(shù)同屬于楊柳科(Salicaceae)，是我國(guó)重要的速生用材、園林綠化與生態(tài)防護(hù)樹(shù)種，廣泛用于制漿造紙、膠合板、纖維板、家具制品等。在北美與歐洲，楊樹(shù)和柳樹(shù)還作為可持續(xù)種植的、優(yōu)質(zhì)的生物能源[1-2]與生物修復(fù)[3-4]材料被大面積推廣與應(yīng)用。目前，我國(guó)楊樹(shù)人工林面積已突破800萬(wàn)hm2，居世界首位，超過(guò)其他國(guó)家楊樹(shù)人工林面積總和。僅江蘇實(shí)施“綠色江蘇”工程10 a以來(lái)，楊樹(shù)人工林栽植面積最高峰時(shí)達(dá)到100萬(wàn)hm2。而江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院選育的20余個(gè)不同用途的‘蘇柳’系列柳樹(shù)優(yōu)良品種，已在我國(guó)東北、西北、華北、華東及長(zhǎng)江中下游地區(qū)26個(gè)省(市、區(qū))推廣，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益。

近年來(lái)，隨著造林面積的不斷擴(kuò)大，楊樹(shù)、柳樹(shù)的優(yōu)良品種的選育與推廣也發(fā)展迅速。但楊樹(shù)、柳樹(shù)的品種間形態(tài)極為相似，僅從表型性狀難以對(duì)插穗或在苗期進(jìn)行品種間的區(qū)分，各產(chǎn)區(qū)間相互引種時(shí)經(jīng)常造成品種混淆，且楊樹(shù)與柳樹(shù)無(wú)性繁殖簡(jiǎn)單，部分種苗經(jīng)營(yíng)者由于利益驅(qū)動(dòng)甚至故意造假，給造林生產(chǎn)帶來(lái)極大的損失。因此，建立一種快速、高效、穩(wěn)定、可靠的楊樹(shù)、柳樹(shù)品種鑒定體系尤為重要，不僅有助于不同地域間優(yōu)良品種的推廣，而且還能保護(hù)品種所有權(quán)人的權(quán)益，規(guī)范種苗生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)，引導(dǎo)種苗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

分子標(biāo)記可直接反映個(gè)體DNA水平上的差異，不受環(huán)境與季節(jié)的影響，過(guò)程簡(jiǎn)便且結(jié)果可靠，可有效彌補(bǔ)依據(jù)表型性狀進(jìn)行品種鑒定的不足。眾多分子標(biāo)記中，微衛(wèi)星(microsatellite)標(biāo)記因其數(shù)量眾多、分布廣泛、共顯性與重復(fù)性好、通用性高，已廣泛應(yīng)用于如楊樹(shù)[5-6]、桉樹(shù)[7-8]、胡桃[9]、油橄欖[10]、荔枝[11]、茶樹(shù)[12]、海棠[13]、桂花[14]等多個(gè)木本植物的品種鑒定與指紋圖譜構(gòu)建研究。隨著楊樹(shù)與柳樹(shù)多個(gè)樹(shù)種全基因組測(cè)序相繼完成[15-18]，大量的基因組信息被陸續(xù)公布，同時(shí)基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也開(kāi)發(fā)出了眾多的楊樹(shù)與柳樹(shù)EST-SSR標(biāo)記[19-20]，為楊樹(shù)與柳樹(shù)遺傳學(xué)與基因組學(xué)的研究提供了現(xiàn)成的可用資源。相比楊樹(shù)而言，國(guó)內(nèi)柳樹(shù)分子生物學(xué)研究起步較晚，在利用SSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品種鑒定與指紋圖譜構(gòu)建方面僅見(jiàn)王源秀等[21]對(duì)杞柳和簸箕柳雜交親本進(jìn)行DNA指紋圖譜分析的報(bào)道。鑒于此，本研究利用前期基于垂柳和簸箕柳轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行楊樹(shù)和柳樹(shù)種間通用性檢測(cè)，并利用熒光標(biāo)記分型技術(shù)構(gòu)建33份楊樹(shù)和柳樹(shù)優(yōu)良品種的指紋圖譜，以期為楊樹(shù)與柳樹(shù)優(yōu)良品種的鑒定、保護(hù)與推廣工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及引物篩選

本研究試驗(yàn)材料包括21個(gè)柳樹(shù)品種和12個(gè)楊樹(shù)品種，共計(jì)33份材料(表1)。除竹柳(編號(hào)13)和8個(gè)美國(guó)引進(jìn)的商業(yè)品種(編號(hào)14-21)外，其余品種均為國(guó)家或省級(jí)認(rèn)(審)定的良種。所有材料均定植于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)。

采集所有參試個(gè)體幼嫩葉片，DNA提取方法參考鄭紀(jì)偉等[22]的方法。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，Nanodrop檢測(cè)DNA質(zhì)量與濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

從前期已發(fā)表的柳樹(shù)EST-SSR標(biāo)記中隨機(jī)挑選通用性較高的38對(duì)引物[20]，并以所有楊樹(shù)與柳樹(shù)品種為模板進(jìn)行標(biāo)記初篩，最終確定12對(duì)EST-SSR標(biāo)記用于指紋圖譜構(gòu)建(表2)。

PCR為10 μL反應(yīng)體系，包含Buffer 1 μL，dNTPs 0.025 μL，Taq酶0.1 μL，Mg2+0.6 μL，前后項(xiàng)引物各0.5 μL，DNA模板 1μL，ddH2O 6.27 5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 試驗(yàn)材料Table 1 Experimental materials

表2 12對(duì)EST-SSR引物信息Table 2 Details of 12 EST-SSR primer pairs

表2(續(xù))

1.2 基因分型

利用熒光dUTP(Fermentas Inernational Inc.,Burlington,Canada)法進(jìn)行基因分型。PCR為10 μL反應(yīng)體系，加入0.01 μL dUTP，總體積不變，擴(kuò)增程序?yàn)閠ouch-down：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，66 ℃→56 ℃退火(每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃)30 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物并按體積比1∶4加入緩沖液稀釋(7.82 μL高純甲酰胺+0.18 μL GeneScan 500 LIZ)，95 ℃變性5 min后迅速置于冰上冷卻，放入ABI 3130測(cè)序儀(Applied Biosystems,Foster City,CA)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)?；蚍中桶窜浖礼eneMapper 4.0 (Applied Biosystems)中的Standard Module進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)等位基因數(shù)、等位片段大小，并按以下公式計(jì)算各位點(diǎn)多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。

式中：CPIC為各位點(diǎn)多態(tài)信息含量，n為EST-SSR標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)量總和，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率。按多態(tài)性條帶的有無(wú)將等位基因轉(zhuǎn)化為0/1矩陣并計(jì)算SM相似性系數(shù)，利用NTSYS-pc version 2.1按UPGMA法對(duì)33個(gè)品種進(jìn)行聚類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記通用性分析

利用38對(duì)基于垂柳和簸箕柳開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記在楊樹(shù)和柳樹(shù)品種中進(jìn)行擴(kuò)增，其中26對(duì)在所有柳樹(shù)品種中均能擴(kuò)增成功，通用性為68.4%，22對(duì)能在楊樹(shù)品種中擴(kuò)增成功，通用性為57.89%。從中選擇12對(duì)多態(tài)性較好的標(biāo)記用于下一步基因分型與指紋圖譜構(gòu)建。

2.2 標(biāo)記多態(tài)性分析

對(duì)EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性的檢測(cè)結(jié)果(表3)表明，12個(gè)EST-SSR標(biāo)記共擴(kuò)增出97條等位片段，每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)5～13個(gè)不等，平均為8.1個(gè)。其中位點(diǎn)SALeSSR0346擴(kuò)增的等位基因數(shù)最多，為13個(gè)；位點(diǎn)SALeSSR0279擴(kuò)增的等位基因數(shù)最少，為5個(gè)。12個(gè)EST-SSR標(biāo)記的PIC變化范圍為0.637 2(SALeSSR0108)～0.834 8(SALeSSR0296)，平均為0.781 7。圖1為SALeSSR069標(biāo)記在部分品種中的基因分型結(jié)果。

表3 13對(duì)EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Table 3 Polymorphism detection of the 13 pairs of EST-SSR markers

圖1 SLAeSSR069標(biāo)記在部分品種中的基因分型Fig.1 Genotyping by SLAeSSR069 marker for partial varieties

2.3 指紋圖譜構(gòu)建

對(duì)12個(gè)EST-SSR位點(diǎn)的等位片段進(jìn)行進(jìn)一步分析，從中挑選出3對(duì)核心引物用于構(gòu)建指紋圖譜(表4)。其中，引物SALeSSR0346可以區(qū)分13個(gè)品種，引物SALeSSR0340能區(qū)分6個(gè)品種，引物SALeSSR0259能區(qū)分7個(gè)品種。通過(guò)引物SALeSSR0346與SALeSSR0340的組合即可完全區(qū)分12個(gè)楊樹(shù)品種，而通過(guò)增加引物SALeSSR0259的組合即可完全區(qū)分包含柳樹(shù)在內(nèi)的所有33個(gè)品種。

表4 33個(gè)楊樹(shù)與柳樹(shù)品種的指紋圖譜Table 4 Fingerprints of 33 varieties of Populus and Salix

2.4 聚類(lèi)分析

根據(jù)12個(gè)EST-SSR標(biāo)記擴(kuò)增的條帶數(shù)據(jù)計(jì)算各品種間相似性系數(shù)，并按UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)(圖2)。33個(gè)品種間的遺傳相似系數(shù)為0.68～0.96，分別聚成楊屬和柳屬兩大類(lèi)群。

圖2 33個(gè)楊樹(shù)與柳樹(shù)品種的聚類(lèi)Fig.2 Dendrogram of 33 varieties of Populus and Salix

柳屬的類(lèi)群又分為兩大分支：其中一支包含‘蘇柳172’、‘蘇柳795’、‘蘇柳799’、‘竹柳’、‘蘇柳932’、‘蘇柳1010’和‘蘇柳1011’共7個(gè)品種，均為喬木柳。其中親緣關(guān)系相近的‘蘇柳795’與‘蘇柳799’來(lái)源于同一個(gè)旱白柳的雜交組合，‘蘇柳1010’和‘蘇柳1011’來(lái)源于同一個(gè)垂白柳的雜交組合?！K柳932’雖然也來(lái)源于垂白柳的雜交組合，但父母本與‘蘇柳1010’、‘蘇柳1011’的親本均不相同。另外一支包含‘蘇柳52-2’等14個(gè)灌木柳品種?！K柳52-2’與‘蘇柳8-26’親緣關(guān)系較近，雖然雜交組合不同，但母本為同一個(gè)簸箕柳。美國(guó)引進(jìn)的8個(gè)商業(yè)品種中，宮部氏柳‘SX64’為雄株，與‘Otisco’聚在一起，推測(cè)可能為‘Otisco’的父本，或與其父本親緣關(guān)系較近。而另一個(gè)宮部氏柳‘SX67’ 也與這兩個(gè)品種單獨(dú)聚類(lèi)成一個(gè)小的分支。‘SV1’與‘S25’聚在一起，推測(cè)鉆石柳‘S25’可能是‘SV1’的其中一個(gè)親本。此外，兩個(gè)歐洲紅皮柳品種‘Fish Creek’與‘Onondaga’也單獨(dú)聚類(lèi)成一個(gè)小的分支。

楊屬的類(lèi)群也分為兩大分支。其中單獨(dú)的一支僅有‘銀中’楊一種，其親本為銀白楊與中東楊，與其他黑楊派的品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；另外一支主要由11個(gè)黑楊派品種組成，其中親緣關(guān)系相近的‘南林95’與‘南林895’來(lái)源于同一個(gè)雜交組合；‘蘇楊7號(hào)’為‘I-69’楊的實(shí)生苗，與‘I-69’楊聚在一起；‘丹紅’楊與‘巨霸’楊來(lái)源于同一個(gè)雜交組合，且母本與‘湘林90’相同，這3個(gè)品種聚成一個(gè)小的分支；歐美楊‘I-107’與‘I-108’親緣關(guān)系相近，也聚成一個(gè)小的分支。

3 討 論

SSR標(biāo)記在基因組中各個(gè)區(qū)域廣泛分布。EST-SSR標(biāo)記來(lái)源于轉(zhuǎn)錄區(qū)域，與基因組SSR標(biāo)記相比，通常認(rèn)為其更加保守且多態(tài)性較低[23]，但其通用性較之基因組SSR要更高，開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記不但可應(yīng)用于近緣種及屬間[24-25]，甚至可應(yīng)用于不同亞科與科之間[26-27]。Tuskan等[28]預(yù)測(cè)來(lái)源于毛果楊全基因組序列的SSR標(biāo)記有30%～50%能用于柳樹(shù)，但楊彥伶等[29]發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)基因組SSR在柳樹(shù)中的通用性只有10.4%，而楊樹(shù)EST-SSR標(biāo)記在柳樹(shù)中的通用性可達(dá)到54.2%。與此類(lèi)似的，韓騫等[30]的研究表明：楊樹(shù)中篩選的10對(duì)引物有6對(duì)在柳樹(shù)中有擴(kuò)增，柳樹(shù)中篩選的10對(duì)引物有8對(duì)在楊樹(shù)中有擴(kuò)增。由此可見(jiàn)，已選取的38對(duì)柳樹(shù)EST-SSR標(biāo)記中有22對(duì)在楊樹(shù)中擴(kuò)增成功，通用性只有57.89%，較之韓騫等[30]的報(bào)道要低，但其所用的標(biāo)記數(shù)量較少。盡管本研究所采用的EST-SSR標(biāo)記來(lái)源于垂柳和簸箕柳，但也僅有26對(duì)(68.4%)標(biāo)記在所有柳樹(shù)品種中擴(kuò)增成功，推測(cè)可能是由于柳樹(shù)種類(lèi)繁多，樹(shù)種間分化較為復(fù)雜造成的，類(lèi)似的情形在課題組前期的報(bào)道中也有所發(fā)現(xiàn)[20]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)SALeSSR0696標(biāo)記中有1個(gè)等位片段僅在所有楊樹(shù)品種中出現(xiàn)，而在所有柳樹(shù)品種中缺失，后期可進(jìn)一步驗(yàn)證能否作為屬間特異性的標(biāo)記。

楊樹(shù)與柳樹(shù)起源于共同的古四倍體祖先，古四倍體祖先基因組重新二倍化形成楊樹(shù)和柳樹(shù)兩個(gè)分支[17]。自然界中楊樹(shù)大多為二倍體，而柳樹(shù)倍性較為復(fù)雜，從二倍體至十二倍體均存在，甚至同一個(gè)種內(nèi)還存在不同倍性的情況[31]。一般而言，灌木類(lèi)的柳樹(shù)大多為二倍體，喬木類(lèi)的柳樹(shù)大多為多倍體[31]。雖然SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，在二倍體個(gè)體中可以區(qū)分純合子與雜合子，但在多倍體中較難區(qū)分各種基因型，且目前尚未有合適的統(tǒng)計(jì)軟件用于計(jì)算各位點(diǎn)的參數(shù)值，如雜合度等。傳統(tǒng)的高分辨率瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳基因分型技術(shù)分辨率有限，難以區(qū)分較小的等位片段差異，條帶判讀時(shí)主觀性比較大，目前大多采用熒光標(biāo)記結(jié)合高通量毛細(xì)管電泳的分型技術(shù)。熒光標(biāo)記主要包括M13引物[32-33]、dUTP核酸標(biāo)記熒光染料[7]，以及熒光標(biāo)記引物[27,34]等，總體而言，熒光標(biāo)記引物的分型效果要優(yōu)于M13引物和 dUTP核酸標(biāo)記熒光染料。

本研究中，33個(gè)楊樹(shù)和柳樹(shù)品種的親緣關(guān)系基本與品種的遺傳背景相吻合，也符合傳統(tǒng)的楊柳科系統(tǒng)分類(lèi)，得出的結(jié)論也與韓騫等[30]、賈會(huì)霞等[35]的研究一致。部分品種雖然來(lái)自同一個(gè)雜交組合，但由于性狀分離而生長(zhǎng)后期表型差異較大，從外觀形態(tài)上也能區(qū)分出來(lái)，如‘蘇柳1010’與‘蘇柳1011’，‘蘇柳795’與‘蘇柳799’，‘南林95’與‘南林895’等。值得一提的是，本研究中加入‘竹柳’這一品種，主要是由于其較為耐鹽，且干型、速生性較好，在沿海及北方一些地區(qū)應(yīng)用較多。竹柳最初被報(bào)道由美國(guó)寒竹、朝鮮柳和筐柳雜交而成，并從美國(guó)引進(jìn)。但從雜交可配性上看是不可能實(shí)現(xiàn)的，另外經(jīng)江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院柳樹(shù)研究團(tuán)隊(duì)調(diào)查，美國(guó)柳樹(shù)研究相關(guān)機(jī)構(gòu)從未選育出該喬木柳品種。而從本研究以及賈會(huì)霞等[35]的研究來(lái)看，‘竹柳’與‘蘇柳172’、‘蘇柳795’、‘蘇柳799’親緣關(guān)系較近，極有可能來(lái)源于相同或相近的親本，但具體是哪一個(gè)無(wú)性系，還需進(jìn)一步的鑒定與驗(yàn)證。由此可見(jiàn)，利用分子標(biāo)記對(duì)品種進(jìn)行鑒定與保護(hù)尤為重要。