SARS-CoV-2基因組RNA標準物質(zhì)的研制

王 迪， 王志棟， 吳 梟， 牛春艷， 董蓮華， 戴新華， 高運華

(中國計量科學研究院前沿中心，北京100029)

1 引 言

當前新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)對全球公共衛(wèi)生安全造成了嚴重的威脅[1～5]。這種傳染病于2020年初被大量發(fā)現(xiàn)，我國科學家在短時間內(nèi)從患者體內(nèi)分離出SARS-CoV-2病毒并進行了基因組測序，于2020年1月12日向世衛(wèi)組織提供其基因組序列信息[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)該病毒為一種β屬的冠狀病毒，遺傳物質(zhì)為線性單股正鏈的RNA。SARS-CoV-2基因組序列結構顯示該基因組約29～30 kb，由12個蛋白編碼區(qū)/開放讀碼框組成，其基因特征與SARS-CoV和MERS-CoV有一定區(qū)別，與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性約為80%[8,9]。

目前對SARS-CoV-2感染患者尚無特定的治療方法，及時篩查、早期診斷是緩解病情和阻止疫情進一步擴散的關鍵[10～13]。以“熒光定量PCR”為代表的核酸檢測方法因高靈敏度、高特異性成為新冠病毒診斷的“金標準”[14～16]。目前國內(nèi)研發(fā)生產(chǎn)SARS-CoV-2核酸檢測試劑的企業(yè)就有100家以上，檢測的靶基因主要為ORF1ab和N基因。然而據(jù)報道，采取熒光定量PCR方法陽性檢出率較低。正如王辰院士所說：“并不是所有的病患都能檢測出核酸陽性”。盡管多個因素會影響最終的檢測結果，如樣本采集和保存、病毒變異、儀器性能和人員操作等，但部分SARS-CoV-2熒光定量PCR試劑的質(zhì)量問題也很可能是造成“假陰性”的重要原因。因此研制定值準確、穩(wěn)定可靠的新冠病毒標準物質(zhì)，加強對相關核酸檢測試劑的驗證評價和實驗室的質(zhì)量控制尤為重要。

本標準物質(zhì)基于滅活的人源SARS-CoV-2病毒的基因組RNA樣本，通過數(shù)字PCR方法對E、ORF1ab和N基因拷貝數(shù)濃度值進行了確定，并進行了其均勻性和穩(wěn)定性驗證。該標準物質(zhì)涵蓋了新冠病毒所有特征基因的全部序列，已用于新型冠狀病毒核酸檢測方法開發(fā)、相關試劑驗證評價以及檢測實驗室質(zhì)量控制和測量結果的量值溯源等工作。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

候選物為人源高度純化的SARS-CoV-2病毒基因組RNA，RNA保存液和酵母RNA購自美國Thermo Fisher公司，引物和探針合成自上海Invitrogen生物技術公司，一步法反轉錄數(shù)字PCR試劑盒(One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes)購自美國Biorad公司。

2.2 儀器與設備

QX200數(shù)字PCR儀，購自美國Biorad公司；Light Cycle ?480-II熒光定量PCR儀，購自德國Roche公司；ABI QuantStudio 12 K Flex熒光定量PCR儀，購自美國Thermo Fisher公司；臺式離心機和Milli-Q Advantage純水儀，購自德國Millipore公司；CP225D電子天平，購自Sartorius公司。

2.3 方法

2.3.1 數(shù)字PCR定值方法

引物及探針序列采用世界衛(wèi)生組織(WHO)和中國疾病預防控制中心(CDC)公布的序列。對探針濃度及PCR擴增溫度進行了篩選優(yōu)化，確定的擴增條件如下：45 ℃ 10 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，40個循環(huán)；98 ℃ 10 min。具體序列參考WHO和中國CDC公布的SARS-CoV-2熒光定量PCR檢測推薦的序列，見表1。

2.3.2 標準物質(zhì)制備

1)標準物質(zhì)貯存溶液目標基因拷貝數(shù)濃度的初步確定

取1 μL基因組RNA貯存溶液，用RNA存儲緩沖液，進行10×梯度稀釋，用數(shù)字PCR方法進行初步檢驗，確定貯存溶液的初始濃度和稀釋比例。

表1 數(shù)字PCR的引物和探針Tab.1 Primers and probes used for digital PCR

2)標準物質(zhì)的配制

綜合標準物質(zhì)候選材料的數(shù)量、濃度、數(shù)字PCR方法的線性范圍，以及與實時熒光定量PCR方法的匹配性等因素，確定配制約103copy/μL和 102copy/μL兩個濃度梯度的標準物質(zhì)。

取適量基因組RNA貯存溶液，加入設定比例數(shù)量的RNA存儲緩沖液(內(nèi)含約1 mg/mL的酵母RNA)，在冰水浴中充分震蕩，充分混合均勻，配制成設定濃度的標準物質(zhì)。然后在生物安全柜中分裝到0.5 mL無RNA酶的凍存管中，每管50 μL。

2.3.3 標準物質(zhì)的均勻性檢驗

按照國家計量技術規(guī)范JJF 1343—2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》中對標準物質(zhì)均勻性評估的技術要求，從標準物質(zhì)分裝的初期、中期、末期隨機抽取10管SARS-CoV-2基因組RNA標準物質(zhì)，選擇最小取樣量為5 μL，采用數(shù)字PCR方法進行均勻性測定。每瓶重復檢測3次，并采用方差分析法(F檢驗)對標準物質(zhì)進行均勻性檢驗[17]。

2.3.4 標準物質(zhì)的穩(wěn)定性考察

由于應急所需，此標準物質(zhì)當前只開展了短期穩(wěn)定性考察。儲存溫度為4 ℃，分別在第0日、1日、3日、5日取樣。每次每個儲存溫度隨機選取2個樣本，每個樣本重復測量3測，采用數(shù)字PCR方法檢測E、ORF1ab、N三個基因的濃度。

將特性量值(Y)與時間(X)繪制曲線并擬合，擬合直線斜率b1和斜率的不確定度s(b1)分別為：

(1)

(2)

2.3.5 標準物質(zhì)的定值

采用一步法反轉錄數(shù)字PCR方法對兩種濃度標準物質(zhì)進行定值。每種濃度標準物質(zhì)抽取10個單元，每個單元取樣5 μL，按照第2.2節(jié)中確定的檢測方法分別對3種基因進行定量檢測，每個單元重復測量3次。

3 結果與討論

3.1 均勻性檢驗

3.2 穩(wěn)定性考察

按第2.3.4節(jié)中的方法，監(jiān)測在4 ℃條件下標準物質(zhì)E、ORF1ab和N基因濃度隨時間的變化，來評價標準物質(zhì)的短期穩(wěn)定性，結果如圖1。

表2 兩種標準物質(zhì)均勻性檢驗Tab.2 Homogeneity of the two types of reference materials

圖1 標準物質(zhì)的短期穩(wěn)定性考察(4 ℃保存)Fig.1 Short-term stability of the reference material stored at 4 ℃

根據(jù)圖1的擬合直線，計算斜率b1和s(b1)，并查表得到置信水平0.95的t分布因子。結果如表3所示，3個基因均滿足|b1|

表3 標準物質(zhì)短期穩(wěn)定性測試結果Tab.3 Short-term stability result of the reference material

由于應急所需，標準物質(zhì)暫時未進行長期穩(wěn)定性考察。但是根據(jù)CCQM P199 HIV-1 RNA比對中主導實驗室提供的長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)(可穩(wěn)定保存8個月)，可以預測本標準物質(zhì)的穩(wěn)定性，我們將會對該標準物質(zhì)的長期穩(wěn)定性持續(xù)進行監(jiān)測。

3.3 標準物質(zhì)的定值

按第2.3.1節(jié)中確定的檢測方法，采用一步法逆轉錄數(shù)字PCR分別對E、ORF1ab和N基因進行定量檢測。利用格拉布朗法和夏皮羅-威爾克法進行離群值檢驗和正態(tài)性分析后，所有定值數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，定值數(shù)據(jù)沒有異常值，數(shù)據(jù)均保留(見表4和表5)，其中：SD表示標準偏差，RSD表示相對標準偏差。結果表明，在低濃度和高濃度標準物質(zhì)中，3個基因的RNA濃度是不同的，其中N基因拷貝數(shù)最高，E基因居中，ORF1ab基因拷貝數(shù)最低。

表4 低濃度標準物質(zhì)濃度的數(shù)字PCR定量結果

表5 高濃度標準物質(zhì)濃度的數(shù)字PCR定值結果

3.4 定值結果的不確定度評定

標準物質(zhì)定值結果的總不確定度由3個部分組成[18～20]。第1部分是標準物質(zhì)定值方法的不確定度；第2部分是物質(zhì)不均勻性所引起的標準不確定度；第3部分是物質(zhì)在有效期內(nèi)的不穩(wěn)定性所引起的標準不確定度。表6為不確定度評定結果，合成相對標準不確定度為：

(3)

式中：ucr為標準物質(zhì)定值方法的相對不確定度；ubbr為物質(zhì)不均勻性所引起的相對不確定度；usr為物質(zhì)在有效期內(nèi)的不穩(wěn)定性所引起的相對不確定度。

(1)定值方法的不確定度包括了A類不確定度和B類不確定度。根據(jù)2種標準物質(zhì)定值結果數(shù)據(jù)和測量次數(shù)，計算出每個標準物質(zhì)的A類不確定度ucr(A)；B類不確定度ucr(B)主要是儀器采集熒光信號時產(chǎn)生的不確定度(因儀器按照規(guī)定定期維護，該項忽略不計)和微滴體積引入的不確定度(0.8% )[21,22]。

(2)均勻性檢驗結果表明，標準物質(zhì)在管間具有良好的均勻性。標準物質(zhì)拷貝數(shù)值這一特性量值的均勻性引入的不確定度采用式(4)進行計算：

(4)

式中ν為組內(nèi)自由度。

(3)拷貝數(shù)濃度穩(wěn)定性的不確定度貢獻采用公式：us=s(b1)·X進行計算。

表6 不確定度評定Tab.6 Evaluation of measurement uncertainty (%)

3.5 標準物質(zhì)評審和應用

全國標準物質(zhì)管理委員會組織技術專家對研制的標準物質(zhì)進行了技術評審，并報送國家市場監(jiān)管總局批準，獲得了國家標準物質(zhì)證書，編號分別為GBW(E)091098和GBW(E)091099。

應用研制的標準物質(zhì)，先后完成了對9種SARS-CoV-2病毒qRT-PCR檢測試劑盒的性能評價。結果表明盡管不同試劑盒選擇的靶基因檢測區(qū)段存在差異，但以該標準物質(zhì)為模板，這9種檢測試劑盒均能擴增產(chǎn)生目標核酸片段，成功完成了性能評價工作。這說明該基因組RNA標準物質(zhì)具有普遍適用性，可廣泛應用于各類新冠相關核酸檢測方法的開發(fā)，試劑的驗證評價以及檢測實驗室的質(zhì)量控制。這9種試劑盒的信息見表7。

4 結 論

針對新型冠狀病毒標準物質(zhì)缺乏的現(xiàn)狀，研制了高低2種水平的新冠病毒基因組RNA標準物質(zhì)。該標準物質(zhì)具有新冠病毒完整的核酸序列，對不同核酸檢測試劑盒具有普遍的適用性。利用研制的標準物質(zhì)對9種SARS-CoV-2熒光定量PCR檢測試劑盒的性能進行評價，證實了標準物質(zhì)的適用性良好。同時研制的標準物質(zhì)為新型冠狀病毒核酸檢測方法的開發(fā)、實驗室質(zhì)量控制以及測量結果的量值溯源等提供了重要的標準和計量技術支撐，為新型冠狀病毒的檢測奠定了一定的技術基礎。

表7 qRT-PCR試劑盒信息Tab.7 qRT-PCR kit information