NaCl脅迫對(duì)不同抗性菜用大豆結(jié)瘤固氮的影響

孫繼鑫，徐志偉，代重陽(yáng)，孟 飛，王 聰

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028043；2.呼和浩特市賽罕區(qū)蔬菜局，內(nèi)蒙古 呼和浩特010000）

豆科植物和根瘤菌共生固氮所產(chǎn)生的生物固氮體系是自然界中最重要體系之一［1］，根瘤的共生固氮對(duì)豆科植物產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的提升起重要作用.同時(shí)，對(duì)減少氮肥用量、維持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展以及提高作物品質(zhì)也具有重要意義［2］.豆科植物和根瘤菌之間所產(chǎn)生的共生固氮作用會(huì)受到環(huán)境因子的限制，特別是逆境脅迫會(huì)對(duì)豆科植物根瘤的形成、發(fā)育以及根瘤的固氮效率產(chǎn)生影響，并對(duì)豆科植物和根瘤菌建立共生體系有重大影響［3］.李梅等［4］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽濃度升高至100 mmol·L-1時(shí)，根瘤數(shù)量和固氮區(qū)細(xì)胞數(shù)量會(huì)隨著濃度的升高不斷減少，且根瘤不斷變小.Abdel等［5］表明，較低濃度的鹽脅迫環(huán)境會(huì)對(duì)固氮酶活性和豆血紅蛋白含量產(chǎn)生較多影響，而鹽脅迫濃度較高的環(huán)境會(huì)對(duì)根瘤菌的質(zhì)量和數(shù)量產(chǎn)生更大的影響，同時(shí)，豆科植物和根瘤菌良好的共生關(guān)系也會(huì)使植物的耐鹽性得到提高.

菜用大豆是蔬菜食用大豆的總稱，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來我國(guó)菜用大豆的栽培面積逐年增加，但中國(guó)的鹽堿土總面積超過900 0萬(wàn)hm2，且受全球氣候變暖、工業(yè)污染加劇和化肥施用不當(dāng)?shù)纫蛩赜绊?，土壤鹽漬化不斷加重，導(dǎo)致豆科植物的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到嚴(yán)重威脅［6-9］.因此，如何緩解鹽脅迫傷害，在逆境下維持豆科植物較強(qiáng)的結(jié)瘤固氮能力，已成為當(dāng)前迫切需要解決的問題.本研究以耐鹽品種和鹽敏感品種的菜用大豆與根瘤菌共生體為試材，研究NaCl脅迫對(duì)菜用大豆結(jié)瘤固氮的影響，以期為豆科植物抗鹽機(jī)理的深入研究奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 菜用大豆品種為鹽敏感品種“日本青”和耐鹽品種“綠領(lǐng)八號(hào)”（耐鹽性為前期試驗(yàn)篩選）.“日本青”接種與其共生匹配性較好的快生型根瘤菌HH103，“綠領(lǐng)八號(hào)”接種與其共生匹配性較好的慢生根瘤菌USDA122，均購(gòu)自黑龍江省農(nóng)科院微生物研究所［10］.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試材培育 挑選種皮較飽滿的種子用95%乙醇沖洗，播種于口徑10 cm、高10 cm的塑料缽中，采用蛭石作為基質(zhì)，在每缽中播種2粒，定植1株，于人工氣候箱中進(jìn)行培育.

1.2.2 試驗(yàn)處理 試驗(yàn)設(shè)0（CK），50，75，100，125 mmol·L-15個(gè)NaCl濃度處理.待幼苗2片真葉完全展開后，在1/4 濃度無氮營(yíng)養(yǎng)液中加入不同濃度的NaCl，在基質(zhì)中均勻澆入；使用無菌水配置的水溶液施用于上述各處理，每處理10株，3次重復(fù)，完全隨機(jī)排列.

1.2.3 菌懸液制備 通過活化、純化后將根瘤菌接種到液體培養(yǎng)基中，在29 ℃、180 r·min-1振蕩條件下黑暗培養(yǎng)，慢生菌種培養(yǎng)72 h，快生菌種培養(yǎng)48 h.

1.2.4 接種 NaCl處理后隨即在幼苗的2片真葉完全展開后進(jìn)行接種.將稀釋后的根瘤菌懸浮液在幼苗根部周圍用移液槍給每株接種1 mL.

1.3 指標(biāo)測(cè)定 根瘤固氮酶活性的測(cè)定見參考文獻(xiàn)［11］；豆血紅蛋白含量的測(cè)定見參考文獻(xiàn)［12］；根瘤類菌體NH3含量、根瘤細(xì)胞漿NH3含量見參考文獻(xiàn)［13］；根系活力的測(cè)定見參考文獻(xiàn)［14］.

1.4 數(shù)據(jù)分析 方差分析等使用Excel與SPSS軟件進(jìn)行分析并處理數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)生物量的影響 由表1可知，在不同濃度NaCl處理下，2個(gè)菜用大豆品種的地上部及地下部生物量均較對(duì)照顯著降低，且降幅隨NaCl 濃度的增大而增加，日本青地上部、地下部生物量在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl濃度下的降幅分別為16%，28%，36%，41%和28%，49%，51%，59%；綠領(lǐng)八號(hào)地上部、地下部生物量的降幅分別為13%，18%，37%，40%和22%，33%，47%，53%.除了在100 mmol·L-1NaCl濃度下綠領(lǐng)八號(hào)的地上部降幅高于日本青外，其余不同脅迫濃度下的降幅均低于日本青，同時(shí)，2個(gè)品種地下部生物量在不同濃度下的降幅均高于地上部.表明NaCl脅迫下2個(gè)品種地上部和地下部的生長(zhǎng)均受到顯著抑制，且受抑制程度隨著脅迫濃度的增加呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，而鹽脅迫的危害對(duì)于根系更加嚴(yán)重.與日本青相比，NaCl脅迫對(duì)綠領(lǐng)八號(hào)根系及地上部生長(zhǎng)的危害均相對(duì)較輕.

Tab. 1 Effects of NaCl stress on biomass of vegetable soybean表1 NaCl脅迫對(duì)菜用大豆生物量的影響

2.2 對(duì)根瘤形成、生長(zhǎng)及固氮量的影響 由表2可知，在不同濃度NaCl處理下，日本青的根瘤數(shù)、根瘤鮮重、地上部植株含氮量、地下部植株含氮量均較對(duì)照顯著降低，除了根瘤鮮重在125 mmol·L-1時(shí)和地下部植株含氮量在100 mmol·L-1時(shí)降低幅度隨NaCl濃度的增大而減小外，其余濃度下降幅度均隨NaCl濃度的增大而增加.在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl 處理下，根瘤數(shù)、根瘤鮮重較對(duì)照的降幅分別為21%，33%，46%，51%和21%，29%，41%，38%；地上部、地下部植株含氮量較對(duì)照的降幅分別為8%，10%，18%，21%和19%，30%，28%，35%.綠領(lǐng)八號(hào)在不同脅迫濃度下根瘤數(shù)、根瘤鮮重較對(duì)照的降幅分別為16%，30%，41%，47%和15%，25%，33%，35%；地上部、地下部植株含氮量較對(duì)照的降幅分別為7%，12%，17%，20%和14%，24%，21%，32%.綠領(lǐng)八號(hào)的根瘤數(shù)、根瘤鮮重及根系含氮量的降幅均低于日本青.表明NaCl脅迫下對(duì)2個(gè)品種根瘤形成、生長(zhǎng)及固氮均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，且受抑制程度隨著脅迫濃度的增大呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì).與日本青相比，綠領(lǐng)八號(hào)在NaCl脅迫下保持了相對(duì)較強(qiáng)的結(jié)瘤、固氮能力.

表2 NaCl脅迫對(duì)菜用大豆根瘤形成、生長(zhǎng)及固氮量的影響Tab. 2 Effects of NaCl stress on root nodule formation，growth and amount of nitrogen fixation of vegetable soybean

2.3 對(duì)大豆根系活力的影響 由圖1可知，在不同濃度NaCl處理下，2個(gè)品種的根系活力均較對(duì)照顯著降低，且降幅隨NaCl濃度的增大而增加，日本青根系活力在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl濃度下的降幅分別為17%，29%，66%，71%；綠領(lǐng)八號(hào)根系活力的降幅分別為17%，27%，54%，61%.除了在50 mmol·L-1NaCl濃度下綠領(lǐng)八號(hào)降幅與日本青相同外，其余不同脅迫濃度下的降幅均低于日本青.表明NaCl脅迫下2個(gè)品種的根系活力均受到顯著抑制，且受抑制程度隨著脅迫濃度的增加呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，與日本青相比，綠領(lǐng)八號(hào)的根系活力在不同濃度NaCl脅迫下均保持相對(duì)較高活力.

2.4 對(duì)大豆根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性的影響 由表3可知，在不同濃度NaCl處理下，日本青的根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性均較對(duì)照顯著降低，除了根瘤豆血紅蛋白含量在125 mmol·L-1時(shí)降低幅度隨NaCl濃度的增大而減小外，其余濃度下降幅均隨NaCl濃度的增大而增加.在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl處理下，根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性較對(duì)照降幅分別為9%，19%，33%，28%和13%，26%，33%，34%.綠領(lǐng)八號(hào)在不同脅迫濃度下根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性均較對(duì)照降幅分別為7%，15%，26%，26%和9%，23%，30%，30%.綠領(lǐng)八號(hào)的根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶活性的降幅均低于日本青.表明NaCl脅迫下對(duì)2個(gè)品種固氮酶活性的提高以及根瘤豆血紅蛋白的合成均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，且受抑制程度隨著脅迫濃度的增大不斷增強(qiáng)，但當(dāng)濃度達(dá)到125 mmol·L-1時(shí)受抑制程度隨著脅迫濃度的增大開始減弱.與日本青相比，綠領(lǐng)八號(hào)維持了相對(duì)較高的根瘤豆血紅蛋白含量和較強(qiáng)的固氮酶活性.

2.5 對(duì)根瘤類菌體中氨含量和根瘤細(xì)胞漿中氨含量的影響 由表4可知，在不同濃度NaCl處理下，日本青根瘤類菌體中氨含量較對(duì)照顯著降低，且降幅隨NaCl濃度的增大而增加，在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl處理下，其降幅分別為8%，13%，23%，27%；綠領(lǐng)八號(hào)在50 mmol·L-1NaCl濃度下的根瘤類菌體中氨含量未受顯著影響，然而隨著脅迫濃度升高，氨的形成受到顯著抑制，氨含量在75，100，125 mmol·L-1NaCl降幅分別達(dá)11%，20%，21%.2個(gè)品種根瘤細(xì)胞漿中氨含量在50 mmol·L-1NaCl下均未受顯著影響，其余濃度下均顯著升高，日本青較對(duì)照的增幅分別為27%，28%，45%.綠領(lǐng)八號(hào)的增幅分別為22%，32%，40%.可見NaCl 脅迫對(duì)2 個(gè)品種根瘤中N2的還原及NH3的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，但較低濃度的NaCl對(duì)NH3轉(zhuǎn)化的影響不顯著.綠領(lǐng)八號(hào)與日本青相比，在NaCl脅迫下顯示出較強(qiáng)的N2固定及轉(zhuǎn)化能力.

圖1 NaCl脅迫對(duì)菜用大豆根系活力的影響Fig. 1 Effects of NaCl stress on root activity of vegetable soybean

表3 NaCl脅迫對(duì)菜用大豆根瘤豆血紅蛋白含量和固氮酶的影響Tab. 3 The effects of NaCl stress on the hemoglobin content and nitrogenase activity of vegetable soybean root nodule leghemoglobin

表4 NaCl脅迫對(duì)菜用大豆根瘤類菌體和細(xì)胞漿中氨含量的影響Tab. 4 Effects of NaCl stress on ammonia content in root nodule bacteria and cytoplasm of vegetable soybean

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫會(huì)使豆科植物根瘤的形成、發(fā)育及根瘤的固氮效率受到影響.王登科等［15］研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對(duì)根瘤菌的生長(zhǎng)起到抑制作用，最終使豆科植物的早期生長(zhǎng)由于根瘤菌的抗氧化能力降低而受到限制.較低濃度的NaCl影響的是豆血紅蛋白含量和根瘤固氮酶活性，而高濃度的NaCl會(huì)使大豆結(jié)瘤數(shù)和根瘤質(zhì)量降低從而降低根瘤的固氮效率［16］.本研究中，2 個(gè)菜用大豆品種根瘤數(shù)、根瘤鮮重、固氮量在不同濃度NaCl脅迫下均顯著下降，且受抑制程度隨著鹽脅迫濃度的增加而呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，這與陳慧等［17］的研究結(jié)果不同.

根系活力是客觀反映植物生理活性的重要指標(biāo)，根系活力的強(qiáng)弱直接影響植物對(duì)土壤中礦物質(zhì)元素和水分的吸收能力.NaCl 脅迫下菜用大豆根系發(fā)育受阻［18］，根系活力減弱，進(jìn)而導(dǎo)致地上部生長(zhǎng)受阻.根毛在信號(hào)識(shí)別、根瘤菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用，而來自地上部的光合產(chǎn)物是根瘤生長(zhǎng)發(fā)育的重要碳源和能源，因此，菜用大豆根瘤少而小的重要原因之一可能是因根系發(fā)育不良、根系活力減弱導(dǎo)致.

根瘤類菌體中的N2在固氮酶的作用下還原為NH3，并快速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿中，NH3通過谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酰胺合成酶（GS）作用轉(zhuǎn)化為氨基酸，當(dāng)NH3迅速轉(zhuǎn)化為氨基酸并且合成蛋白質(zhì)時(shí)，固氮作用才能不斷進(jìn)行［19］.此外，豆血紅蛋白對(duì)根瘤固氮酶活性需要低氧和高流量條件下才能發(fā)揮作用.豆血紅蛋白可以維持豆科植物根瘤內(nèi)較低O2，并可以給類菌體內(nèi)的含鐵血紅蛋白有效地傳遞O2，且根瘤固氮酶活性也隨其濃度的增大而增加［20-21］.本研究中，不同濃度NaCl脅迫下2個(gè)菜用大豆品種根瘤豆血紅蛋白含量均顯著降低，由于固氮酶活性的發(fā)揮對(duì)低氧高流量環(huán)境的需求隨著根瘤豆血紅蛋白含量的降低而無法保證，進(jìn)而導(dǎo)致固氮酶活性受到抑制.不同濃度NaCl處理后，2個(gè)菜用大豆品種根瘤類菌體中氨含量顯著降低，這與根瘤固氮酶活性降低是由根瘤豆血紅蛋白含量降低所導(dǎo)致有關(guān).同時(shí)，NaCl脅迫下根瘤細(xì)胞漿中NH3濃度顯著增高，表明NaCl 處理造成NH3進(jìn)一步轉(zhuǎn)化障礙，而根瘤固氮酶活性也因細(xì)胞漿中NH3含量的積累產(chǎn)生反饋抑制.

本研究中，不同濃度NaCl處理下，耐鹽品種“綠領(lǐng)八號(hào)”的結(jié)瘤數(shù)、瘤重及根部固氮量的降幅均低于鹽敏感品種“日本青”，這與綠領(lǐng)八號(hào)在NaCl脅迫下能維持相對(duì)較高的豆血紅蛋白含量、固氮酶活性，較強(qiáng)的根系活力以及較強(qiáng)的NH3轉(zhuǎn)化能力密切相關(guān).值得注意的是，NaCl脅迫下2品種菜用大豆地上部含氮量的降幅相近且均大幅低于地下部，表明NaCl脅迫下，菜用大豆將固定轉(zhuǎn)化的氮素優(yōu)先供給地上部，且2個(gè)品種氮素向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)能力相近.

根系活力、根瘤豆血紅蛋白含量、固氮酶活性及NH3的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化能力顯著下降，是NaCl脅迫導(dǎo)致2個(gè)菜用大豆品種根瘤形成及發(fā)育受阻、固氮效率下降的重要因素.NaCl脅迫下，耐鹽品種“綠領(lǐng)八號(hào)”具有相對(duì)較強(qiáng)的結(jié)瘤固氮能力，這與其能夠維持相對(duì)較強(qiáng)的根系活力、根瘤豆血紅蛋白含量、固氮酶活性及NH3的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化能力密切相關(guān).