土施納米氧化鋅對蚯蚓生理和黃瓜幼苗生長的影響

楊靜雅，符倩，張皓月，彭晴晴，鐘民正，毛暉*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院，陜西 楊凌 712100）

鋅參與人體內(nèi)200 多種酶和蛋白質(zhì)的組成，作為許多酶的催化劑，是人體必需的微量元素。目前，世界人口鋅缺乏是一個全球性的健康問題，主要原因是鋅攝取量低。因此，越來越多研究致力于食品增鋅，希望通過增加作物鋅含量來提高人體對鋅的攝入量。施用鋅肥作為一種普遍應用的方法，可在短期內(nèi)有效增加作物鋅含量，同時也可以增加土壤有效鋅含量，為生物強化奠定基礎。近年來，作為生產(chǎn)量位居世界第三的金屬納米材料，納米氧化鋅（Zinc oxide nanoparticles，ZnO NPs）在農(nóng)業(yè)方面的應用越來越受到重視，且增鋅效果已初見成效[1-3]。然而，廣泛大規(guī)模的使用，在給人類帶來巨大利益的同時也存在著潛在風險。ZnO NPs 的生產(chǎn)、使用和處置，使其最終不可避免地進入環(huán)境中，影響生態(tài)環(huán)境及生物健康。尤其是在土壤環(huán)境中，ZnO NPs 作為鋅肥和殺蟲劑廣泛使用[4-5]，其生物安全性及潛在影響已不容忽視。

近年來，越來越多的研究表明，ZnO NPs 的獨特性質(zhì)會使其毒性增加。Xiang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)1～80 mg·L-1的ZnO NPs 溶液明顯抑制了白菜根的伸長。Hira等[7]證實了NPs 對黑菜萌發(fā)和莖部生長的影響。He等[8]研究了ZnO NPs 在線蚓中的動態(tài)積累和毒性效應，通過計算ZnO NPs 懸浮液中的Zn2+濃度，發(fā)現(xiàn)懸浮液中以 NPs 顆粒為主，而不是 Zn2+。?wi?tek 等[9]發(fā)現(xiàn)在暴露于ZnO NPs 污染土壤中48 h后，蚯蚓腸道上皮受到一定程度的損傷。Alves 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs 超過400 mg·kg-1時會對蚯蚓的繁殖率產(chǎn)生毒性影響，而濃度大于4 000 mg·kg-1時會對彈尾蟲的繁殖率產(chǎn)生顯著影響。因此，研究ZnO NPs 對土壤生態(tài)環(huán)境的毒理效應是一個越來越受到科學關注的重要課題，可以為評估ZnO NPs 對土壤帶來的環(huán)境風險提供依據(jù)。

黃瓜是一種富含多種營養(yǎng)元素的蔬菜，具有生長速度快、對鋅濃度的響應較好的特點[11]。黃瓜葉片面積較大，蒸騰速率高，比其他糧食作物的需水量大，這意味著黃瓜幼苗可能對納米顆粒的吸收更大，導致ZnO NPs 顆?？赡芡ㄟ^食物鏈對人體帶來健康風險。作為一種重要的土壤動物，蚯蚓約占土壤動物生物總量的60%～80%[12]，參與土壤有機質(zhì)的分解、養(yǎng)分循環(huán)利用，且能促進微生物的生命活動[13]。有研究表明，蚯蚓具有體積大、生物量高等特征，且相比其他土壤無脊椎動物更易受到金屬污染影響，適宜作為反映土壤質(zhì)量的生物指示物，廣泛用于重金屬污染和食物鏈傳遞的生態(tài)毒理學研究[14]，其存活率、抗氧化酶活性、抗氧化物質(zhì)含量等是重要的生物標志物，可以有效地反映土壤的健康和安全狀況[12]。赤子愛勝蚓繁殖率高、適應性強，是國際上蚯蚓毒性試驗常用的品種。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓能有效降低土壤環(huán)境中污染物的毒性作用，促進作物的生長。Jiang 等[15]研究指出，蚯蚓能抵抗納米顆粒對番茄植株產(chǎn)生毒性，通過增強植物的抗逆性來幫助植物應對納米顆粒的脅迫。Mkhinini 等[16]也發(fā)現(xiàn)，蚯蚓能夠顯著促進廢水灌溉后的蠶豆植株的生長，保護作物抵抗氧化應激。

目前，有關ZnO NPs 對蚯蚓的毒性效應已有相關報道，但大部分研究都采用非天然土壤介質(zhì)[17]或單一的培養(yǎng)體系[14]，忽略了土壤系統(tǒng)中植物的存在，這種做法可能導致與自然環(huán)境條件下所觀察到的毒性作用明顯不同。土壤是一個非常復雜的系統(tǒng)，具有多種生物種群。土壤性質(zhì)和系統(tǒng)多樣性在很大程度上決定著ZnO NPs 的環(huán)境行為、土壤中的鋅形態(tài)及其生物利用度，因此無法正確、全面地評估ZnO Nps 的生態(tài)毒性。此外，有關ZnO NPs 在自然種植系統(tǒng)中的毒性研究未見報道。綜上所述，本研究采用盆栽試驗，評估ZnO NPs 作為新型肥料，在自然土壤中對黃瓜幼苗生長、蚯蚓生理的影響，以期為評價ZnO NPs對土壤環(huán)境中的作物生長及動物安全的影響提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑

試驗所用試劑盒購于南京建成生物工程研究所，納米氧化鋅（ZnO NPs，粒徑70±10 nm，純度＞99.6%）購自山東宏升材料科技有限公司。

1.1.2 供試動物

赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）購于河北石家莊某養(yǎng)殖場，在試驗開始前馴化一周，選取體型飽滿、色澤鮮艷、環(huán)帶發(fā)育健康的蚯蚓進行試驗。

1.1.3 供試作物

供試作物品種為對鋅敏感的蔬菜黃瓜（亮優(yōu)106）。在試驗開始前先進行發(fā)芽，4 d后移栽，發(fā)芽期不做任何處理。

1.1.4 供試土壤

供試土壤采自陜西省咸陽市永壽縣御駕宮鎮(zhèn)御中村農(nóng)田耕作層（北緯34°49′，東經(jīng)108°11′，海拔1 127 m），年平均降雨量為610 mm，平均氣溫為10.2 ℃，無霜期210 d。隨機采集表層土壤（15～20 cm），自然風干后過2 mm 網(wǎng)篩。土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 試驗設計

本研究以盆栽試驗的形式進行。在整個試驗過程中，平均日溫度為25 ℃，平均夜溫度為20 ℃，平均每日光照時間為16 h，相對濕度為65%，土壤濕度約為田間最大持水量的60%。

現(xiàn)階段，預測環(huán)境中工程納米顆粒（ENP）的濃度仍然存在許多阻礙問題。根據(jù) Jos′ko[18]和 Sun 等[19]的研究表明，土壤和污泥中ZnO NPs 的濃度分別為10～100、17～110 mg·kg-1，且自然土壤中ZnO NPs 的含量每年以0.06 μg·kg-1的速度逐漸增加[19]。雖然該預估值遠小于現(xiàn)有研究得出的對土壤環(huán)境產(chǎn)生毒性效應的濃度，但隨著納米技術的發(fā)展和應用，ZnO NPs 的環(huán)境濃度會快速增加，當其累計到一定程度就會對土壤環(huán)境造成威脅?；诖?，本試驗選擇了更高的濃度來預測其在土壤環(huán)境中的毒性效應，試驗共設置4個濃度梯度（mg·kg-1）：0（CK）、50（Z50）、500（Z500）、1 000（Z1000），以純鋅計量。按N 46 mg·kg-1、P2O539 mg·kg-1、K2O 93 mg·kg-1作為基肥施入，與土壤充分混勻。每組濃度設置16 個重復，每個重復加入2 kg 供試土壤，移栽3 株幼苗。其中，8 個重復加蚯蚓（SE），蚯蚓添加量為每盆20 條，另8 個處理不加蚯蚓（S）。培養(yǎng)28 d后將蚯蚓和黃瓜幼苗取出，用超純水將蚯蚓沖洗干凈，放于25 ℃培養(yǎng)箱中過夜吐泥，備用。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 蚯蚓的分析方法

準確稱取待測組織的質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例加入 9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件機械勻漿，2 500 r·min-1離心10 min，取上清液，即為10%的組織勻漿，用于蛋白定量（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）的測定。具體測定方法和步驟按照相應的試劑盒進行。其中，SOD 測定采用羥胺法，CAT 測定采用紫外法，POD 測定采用比色法，MDA測定采用TBA法，TP測定采用考馬斯亮藍法。

用質(zhì)量分數(shù)為68%的濃HNO3對干燥的蚯蚓樣品進行微波消解，AAS測定鋅含量。

1.3.2 黃瓜的分析方法

黃瓜幼苗收獲后，分別稱取地上部和地下部的鮮質(zhì)量，并計算總生物量。根部用0.01 mol·L-1HNO3清洗，再用去離子水沖洗3 次后吸干表面水分。根系活力測定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法，SOD 測定采用NBT 光還原法，POD 測定采用愈創(chuàng)木酚比色法，CAT 測定采用紫外法，MDA 測定采用 TBA 法，鋅含量采用AAS進行分析測定。

1.4 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

本研究中使用的化學試劑均為優(yōu)級純試劑。采用經(jīng)認證的標準參考材料[GBW10046（GSB-24）]驗證分析過程的準確性，平均回收率為93%。在分析過程中，每測定20個樣品進1次標準樣品進行質(zhì)量控制。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析，采用LSD法進行多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 ZnO NPs對蚯蚓的影響

2.1.1 對存活率的影響

從表2 可以看出，在28 d 的培養(yǎng)周期中，不同濃度的ZnO NPs 處理均未對蚯蚓的存活率產(chǎn)生顯著影響，且存活率均大于87%，表明蚯蚓對ZnO NPs 具有較強的耐受性。

表1 基地土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of base soil

表2 ZnO NPs對蚯蚓存活率的影響Table 2 Effects of ZnO NPs on earthworm survival rate

2.1.2 對抗氧化酶活性和MDA含量的影響

SOD 是一種天然的氧自由基清除劑，在整個酶促防御系統(tǒng)中占有重要地位。從圖1（A）可以看出，與對照組相比，SOD 活性有增加的趨勢，尤其是50、1 000 mg·kg-1處理組，分別較對照提高了16.6%、16.5%，但未達到顯著水平。在圖1（B）中，與對照相比，不同濃度 ZnO NPs 處理中，CAT 活性在 50、500 mg·kg-1略微降低，在高濃度逐漸恢復至超過對照水平，較對照增加了25.7%，但仍未達到顯著水平。如圖1（C）所示，在不同濃度 ZnO NPs 處理下，POD 活性變化差異顯著。在50、500 mg·kg-1時分別較對照顯著降低了29.7%、21.9%，但在高濃度時逐漸恢復至對照水平，這與CAT 活性變化趨勢相似，表明POD 和CAT具有協(xié)同清除H2O2的作用[20]。

MDA 是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量的多少可間接反映ROS 對機體的損傷程度。本試驗中，隨著處理濃度增加，MDA 含量有增加的趨勢，在濃度為1 000 mg·kg-1時變化顯著，達到3.22 nmol·mg-1，較對照提高了19.2%。

2.1.3 對組織鋅含量的影響

鋅是蚯蚓生長、成熟和繁殖所必需的基本元素，因此代謝過程中需要一定水平的鋅元素。從表3 可以看出，與對照相比，隨著ZnO NPs處理濃度增加，蚯蚓體內(nèi)的鋅含量有增加的趨勢，但沒有顯著差異，總體維持在201.91～212.26 mg·kg-1的水平。

2.2 對黃瓜的影響

2.2.1 對幼苗生長的影響

從表4 可以看出，不同濃度ZnO NPs 處理下，黃瓜的生物量發(fā)生了顯著變化。在未添加蚯蚓的處理中，隨著ZnO NPs 濃度的增加，黃瓜的生物量先增加后降低。50 mg·kg-1處理顯著促進了幼苗生長，此時生物量最大，為15.81 g，相比對照增加了33.1%；在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1處理中，生物量呈現(xiàn)下降趨勢，但與對照相比未達到顯著水平。同樣，黃瓜幼苗的根系活力也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在ZnO NPs濃度為50 mg·kg-1時，根系活力顯著增加，高達 25.50 mg·g-1·h-1，是對照的 2.1 倍。隨著處理濃度的增加，根系活力又降低至對照水平，其變化趨勢與生物量一致。

表3 ZnO NPs對蚯蚓組織鋅含量的影響Table 3 Effects of ZnO NPs on Zn content in earthworm tissues

表4 ZnO NPs對黃瓜幼苗生物量及根系活力的影響Table 4 Effects of ZnO NPs on biomass and root activity of cucumber seedlings

觀察同濃度ZnO NPs 處理下蚯蚓對黃瓜幼苗生長的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)在添加蚯蚓后，生物量和根系活性均顯著提高。其中，生物量分別是未添加蚯蚓時的1.99、1.35、2.47、2.65 倍，根系活力是未添加蚯蚓時的3.68、1.37、3.04、3.56 倍，說明蚯蚓極大地促進了黃瓜幼苗的生長。

2.2.2 對抗氧化酶活性和MDA含量的影響

當受到環(huán)境污染物等非生物脅迫時，植物體內(nèi)會產(chǎn)生過多的ROS，從而激活細胞中去除ROS 的抗氧化機制，防止ROS 的潛在毒性危害。SOD、CAT、POD等能清除代謝過程中產(chǎn)生的ROS，使其處于一個較為穩(wěn)定的水平。

圖2 是ZnO NPs 對黃瓜幼苗的抗氧化酶活性及MDA 含量的影響。在未加蚯蚓的處理中，如圖2（A）所示，隨著ZnO NPs 濃度的增加，SOD 活性先增加后降低，均顯著高于對照組。在500 mg·kg-1ZnO NPs處理中，SOD 活性最大，為 3.22 U-1·g-1·min-1，是對照組的3.7倍；50 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1分別是對照組的2.45、1.83 倍。在圖2（B）中，隨著ZnO NPs 處理濃度的增加，CAT 活性逐漸增加，但低濃度處理未達到顯著水平；500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1分別較對照增加了131.1%、127.0%。圖2（C）中，與對照相比，在50、500 mg·kg-1處理中，POD 活性均未發(fā)現(xiàn)明顯變化，但1 000 mg·kg-1處理組的 POD 活性顯著增加，達2 854.58 U-1·g-1·min-1，比對照增加了22.4%。如圖2所示，研究同濃度ZnO NPs 處理中是否添加蚯蚓對黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響，結果表明在添加蚯蚓后，除對照外，SOD活性在低、中、高濃度中均降低，在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1處理中，SOD 活性變化顯著，不加蚯蚓處理組的SOD 活性是添加蚯蚓的4.29、2.74倍。在對照組和低濃度處理下，添加蚯蚓可使黃瓜幼苗的CAT 活性增加，且低濃度處理組差異顯著，是不加蚯蚓的1.77倍；但在中、高濃度下，添加蚯蚓對CAT 活性影響較小。對于植株POD 活性來說，在對照組和所有ZnO NPs 處理組中，添加蚯蚓后均未對POD活性造成顯著影響。

ZnO NPs 對黃瓜幼苗 MDA 含量的影響如圖2（D）所示。在不加蚯蚓的處理中，隨著ZnO NPs 濃度的增加，MDA 含量有增加的趨勢，1 000 mg·kg-1處理組增加達到顯著水平，相比對照增加了34.1%。在同濃度ZnO NPs 處理中，500 mg·kg-1和 1 000 mg·kg-1濃度下，添加蚯蚓后的MDA 含量較未添加蚯蚓時有降低的趨勢，在1 000 mg·kg-1處理中達到顯著水平，僅為不加蚯蚓處理的76.3%。

2.2.3 對鋅含量的影響

圖3 為黃瓜幼苗地上部和地下部的鋅含量。在不加蚯蚓的處理中，隨著ZnO NPs 處理濃度增加，地上部和地下部的鋅含量顯著增加。其中，地上部鋅含量分別是對照的2.79、6.38、8.30 倍，地下部分別是對照的1.31、3.72、6.19 倍。同一濃度的兩種處理中，在添加蚯蚓后，不管是地上部還是地下部鋅含量均有降低的趨勢，說明蚯蚓可能會影響黃瓜幼苗對ZnO NPs的吸收。

3 討論

3.1 對蚯蚓生理的影響

本研究結果表明，即使在1 000 mg·kg-1ZnO NPs處理中，蚯蚓的存活率也大于87%。同樣，在García-Gómez 等[21]的研究中，觀察到蚯蚓在 1 000 mg·kg-1ZnO NPs 處理中培養(yǎng)28 d 后未發(fā)生死亡現(xiàn)象。Alves等[10]也發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs濃度達到4 000 mg·kg-1，蚯蚓在土壤中的存活率大于90%。以往的研究表明在自然土壤中，ZnO NPs 對蚯蚓的死亡率沒有顯著影響，證實了其生長狀況和死亡率不受土壤中分散的NPs 的影響[14]。這可能是因為蚯蚓能夠自我修復，對ZnO NPs有一定的耐受機制。這說明在本研究中，以存活率為指標來表征ZnO NPs 的毒性有限。這種毒害作用可能不會直接造成蚯蚓死亡，但會導致生物體的紊亂和疾病[10]。因此，還需關注其他生理指標，如抗氧化酶和MDA含量的變化等。

生物對環(huán)境脅迫的生物化學反應被認為是環(huán)境污染的早期警告指數(shù)，許多酶活性已被認為是環(huán)境污染的生物標志物。暴露于環(huán)境污染物的生物體中會產(chǎn)生活性氧（ROS），過量ROS 能氧化誘導破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，從而干擾細胞的正常功能。氧化應激在NPs誘導的毒性影響中起著關鍵性的作用，可激活抗氧化酶活性，如SOD、CAT、POD 等。在本試驗中，隨著ZnO NPs 處理濃度的增加，與對照相比，蚯蚓的SOD、CAT 和POD 活性大多未發(fā)生顯著性變化，但呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。Bao 等[22]研究了ZnO NPs 對蚯蚓的影響，發(fā)現(xiàn)在400 mg·kg-1處理下，其SOD 活性與對照無顯著差異，這與本試驗結果一致，表明高濃度處理雖未對蚯蚓產(chǎn)生明顯毒害作用，但在一定程度上誘導了ROS 的產(chǎn)生，激活SOD 作為抵抗氧化應激的機制。分析原因可能與供試土壤呈堿性有關。在堿性條件下，ZnO NPs 不易水解，即產(chǎn)生的Zn2+較少，而Zn2+是造成納米毒性的主要原因[23]，并且土壤的pH 值隨ZnO NPs 處理濃度的增加而升高，導致NPs 更易聚集成微米級別顆粒，從而降低影響。胡長偉等[24]采用濾紙法研究了ZnO NPs 對蚯蚓的毒性效應，結果表明隨著處理濃度的增加，CAT 活性均接近對照組，CAT反應不敏感，這與本試驗結果相似。在50 mg·kg-1和500 mg·kg-1處理下，CAT活性有降低的趨勢可能是因為蚯蚓體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的介入，快速消除了ROS，故CAT活性并未增強。有研究表明重金屬可以占據(jù)CAT 活性位點，抑制底物的吸附，從而降低酶的活性，導致其活性比對照組低[25]。隨著ZnO NPs 處理濃度不斷增加，蚯蚓受到氧化脅迫，CAT 活性逐漸升高，在1 000 mg·kg-1處理下達到42.11 U·g-1prot。這可能是因為CAT 的作用底物為H2O2，是SOD 的產(chǎn)物，此時蚯蚓體內(nèi)SOD 活性的增加會引起H2O2的積累，從而促進CAT 活性的增強，使蚯蚓適應環(huán)境變化，平衡ROS[26]。在Liu 等[27]的研究中，當蚯蚓暴露于不同濃度的甲霜靈后，體內(nèi)的POD 活性沒有明顯變化，說明在該試驗中，CAT 在清除過量H2O2時發(fā)揮了主要作用，從而降低了POD 的負擔，使POD 活性變化不顯著。Hu 等[12]的研究結果表明當ZnO NPs 濃度大于0.1 g·kg-1時，與對照相比，蚯蚓體內(nèi)的MDA 含量開始顯著增加，但在濃度大于0.5 g·kg-1時，該趨勢減小。曹圣來[28]的研究發(fā)現(xiàn)，在水稻土中，1 000 mg·kg-1的ZnO NPs處理下，蚯蚓的MDA含量顯著升高。這些結果都表明在高濃度ZnO NPs 處理下，蚯蚓受到的損傷不能完全被抗氧化酶中和，最終引起細胞損傷。然而，Bao等[22]的研究結果表明在400 mg·kg-1的ZnO NPs處理下，蚯蚓的MDA 有降低的趨勢，作者認為在其試驗中ZnO NPs 有保護蚯蚓不受氧化損傷的作用，也有部分研究同樣提出了該觀點[29-30]，但作用機理還需進一步探究。大部分研究指出，不同的試驗條件對ZnO NPs 的毒性影響較大，包括土壤的基本理化性質(zhì)、暴露時間以及NPs 顆粒本身的影響等，這也可能是造成MDA變化不一致的主要原因。

3.2 對蚯蚓組織鋅含量的影響

在本試驗中，不同濃度的ZnO NPs 處理雖然對蚯蚓的生理造成了一定的影響，但蚯蚓體內(nèi)的鋅含量變化均未達到顯著水平，鋅含量變化范圍為201.91～212.26 mg·kg-1。有研究表明，當土壤中ZnO NPs濃度達到1 000 mg·kg-1時，蚯蚓體內(nèi)的鋅濃度基本維持在100～200 mg·kg-1，這與本試驗結果一致[21，31]。同樣地，?wi?tek 等[32]對蚯蚓進行毒代動力學研究發(fā)現(xiàn)，當ZnO NPs 濃度達到 500、1 000 mg·kg-1時，蚯蚓能有效調(diào)節(jié)體內(nèi)的鋅濃度。以往有研究表明許多無脊椎動物對鋅有非常高的排泄率，這說明在無脊椎動物體內(nèi)，鋅的解毒途徑主要是通過排泄作用[33]。由此推測在本試驗中，造成蚯蚓體內(nèi)鋅含量變化不顯著的主要原因可能是蚯蚓對鋅的排泄率較高。也有研究提出，當NPs顆粒通過攝食途徑被蚯蚓攝入時，它們很有可能停留在蚯蚓的消化道而不能被吸收[34]。Lapied等[35]的試驗表明當TiO2NPs濃度在0～100 mg·kg-1時，蚯蚓在添加馬糞的土壤中暴露2～8周后，沒有發(fā)生生物積累，作者認為可能是由于TiO2NPs沒有穿過蚯蚓的腸道上皮或角質(zhì)層屏障。Richardson等[36]通過研究鎘對蚯蚓上角質(zhì)層的影響發(fā)現(xiàn)，在受到污染物影響時，蚯蚓的上角質(zhì)層加厚，增加鎘進入蚯蚓體內(nèi)的阻力，降低蚯蚓對鎘的吸收，這可能是蚯蚓受到毒性影響的一種自身適應機制。蚯蚓能夠調(diào)節(jié)其組織中的基本金屬元素（如銅和鋅）的濃度達到平衡，加之ZnO NPs的粒徑、濃度等均能影響其生物有效性，所以這也可能造成鋅含量變化不顯著。García-Gómez 等[37]提出，土壤pH 每增加一個單位，土壤中鋅的溶解度就降低100 倍，堿性土壤的黏土含量高于酸性土壤，有助于鋅的保留，從而降低蚯蚓對鋅的可利用性，導致蚯蚓組織鋅含量變化未達到顯著水平。這也從側面證實了蚯蚓對ZnO NPs 的耐受性，故蚯蚓能在高濃度的ZnO NPs 處理中保持較高的存活率。

3.3 對黃瓜幼苗生長的影響

本試驗的研究結果表明，在不加蚯蚓的處理中，隨著ZnO NPs濃度的增加，黃瓜幼苗的生物量和根系活力均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，說明低濃度ZnO NPs 可顯著促進幼苗的生長，中、高濃度下這種促進作用減弱，甚至開始出現(xiàn)抑制生長的現(xiàn)象。高濃度ZnO NPs對植物根系的抑制作用可能表現(xiàn)為破壞植物的根部細胞。Amooaghaie 等[38]在小麥的盆栽試驗中發(fā)現(xiàn)，50 mg·L-1的ZnO NPs 顯著增加了莖和根的鮮質(zhì)量，但當ZnO NPs 濃度增加到大于100 mg·L-1時，其莖和根鮮質(zhì)量均受到抑制。有試驗表明，以200 mg·kg-1為臨界濃度，ZnO NPs 處理下的玉米的根、莖干質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，最高濃度（3 200 mg·kg-1）處理組小于對照組[39]，這與本試驗結果一致。Zhao 等[40]通過試驗表明，在 400 mg·kg-1和 800 mg·kg-1ZnO NPs處理下，黃瓜根系干生物量分別增加10.5%和63%，這與本試驗結果相反，分析原因可能也與供試土壤有關，該研究認為在有機土壤中，ZnO NPs 不會影響黃瓜幼苗的生長。有研究指出，ZnO NPs 可通過影響植物生長的根際細菌抑制吲哚乙酸的產(chǎn)生[41]。這說明在本試驗條件下，當濃度大于50 mg·kg-1時，ZnO NPs可能抑制了黃瓜幼苗分泌吲哚乙酸，從而使其生物量和根系活力呈現(xiàn)出降低的趨勢。

在同濃度的ZnO NPs 處理下，添加蚯蚓的盆栽中，黃瓜幼苗的生物量和根系活力較未添加時顯著增加。這說明蚯蚓極大地促進了植物生長，對作物發(fā)育有積極作用[42]。作為一種非常重要的土壤動物，蚯蚓可以通過掘穴、消化、排泄等活動改變土壤結構，改善土壤理化性質(zhì)，改變微生物活性等[13，43]。在蚯蚓的生命活動過程中，土壤的疏松度增加，有利于氣體交換，改變了土壤的水特性，有機物加速分解，從而增加植物生長所需的營養(yǎng)成分。此外，蚯蚓還在碳、氮、磷循環(huán)中發(fā)揮重要作用，為土壤表面提供食物網(wǎng)，最終使黃瓜幼苗的生物量和根系活力顯著提高。Puga-Freitas 等[44]通過研究指出蚯蚓能夠通過影響植物的根系直接影響生態(tài)系統(tǒng)的功能，通過糞便釋放礦物質(zhì)營養(yǎng)素和植物激素支持作物生長。Banerjee 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓的腸道細菌能調(diào)節(jié)吲哚乙酸、赤霉酸和銨離子的產(chǎn)生，增強1-氨基環(huán)丙烷羧酸脫氨酶活性以及磷酸鹽溶解能力，進而促進植物生長和修復有毒微量元素的毒害作用。這種調(diào)節(jié)作用可能強于ZnO NPs對吲哚乙酸的抑制作用，從而促進幼苗生長。

3.4 對黃瓜幼苗抗氧化酶和MDA含量的影響

在環(huán)境脅迫下，SOD 是抵御ROS 損傷的第一道屏障，分布廣泛，可通過歧化反應將O2-轉化為H2O2，再通過其他酶類將其分解為H2O。這說明在本試驗條件下，隨著濃度的增加，ZnO NPs 對黃瓜幼苗的脅迫作用逐漸增大，植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS 越來越多，從而使SOD 活性不斷上升。當濃度超過500 mg·kg-1時，由于ROS 含量不斷增加，大量SOD 被植物消耗，并且高濃度處理中，由ROS 積累所引起的氧化脅迫可能超過了SOD 的抗氧化作用，抑制了SOD 活性，導致SOD 活性顯著下降，體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除達到動態(tài)平衡。Kim 等[46]在黃瓜幼苗的水培試驗中發(fā)現(xiàn)隨著ZnO NPs處理濃度的增加（0～1 000 mg·L-1），CAT活性顯著增加，這與本試驗結果類似。由于CAT 和POD 均能清除H2O2，但POD 活性在低、中濃度處理組中變化不顯著，說明黃瓜植株受到氧化損傷后，CAT在清除H2O2的過程中占主導地位。在添加蚯蚓的處理組中，由于隨著ZnO NPs 濃度的增加，蚯蚓體內(nèi)的SOD 活性有增加的趨勢，說明蚯蚓可能抵御了部分ZnO NPs 產(chǎn)生的毒性，使黃瓜幼苗受到的脅迫降低，從而使SOD 活性與未加蚯蚓處理相比有降低的趨勢。近來也有試驗證明蚯蚓的存在能夠顯著降低暴露于污染物的植物SOD 活性[15]。SOD 活性的下降可能與幼苗體內(nèi)的O2-減少有關，使其氧化應激下調(diào)。對于幼苗的POD 活性，雖然蚯蚓的存在削弱了ZnO NPs對黃瓜幼苗的氧化脅迫，降低了SOD 的活性，但是即使是在這種情況下，植株體內(nèi)本身還維持在較高的氧化應激水平，仍然需要大量CAT和POD保持在較為活躍的狀態(tài)，以清除體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2。這說明蚯蚓在某種程度上可以緩解ZnO NPs 對植株造成的氧化應激，抑制或穩(wěn)定其抗氧化酶的活性。

ROS 可干擾細胞膜，促進脂質(zhì)過氧化，導致MDA的釋放。因此，ROS的濃度直接反映了細胞對這種脅迫的響應程度。在低、中濃度下，由于氧化應激的作用，SOD 等抗氧化酶活性增加，在清除ROS 的同時對細胞起到了保護作用[28]，故植株MDA 含量變化不顯著。然而，在高濃度處理下，植株受到的損傷不能完全被抗氧化酶中和，導致MDA 含量顯著上升。在本試驗中，發(fā)現(xiàn)MDA 含量的增加與幼苗生長參數(shù)的降低有關，生物量和根系活力越小，MDA含量越高，這與Mkhinini 等[16]的試驗結論一致。添加蚯蚓后，MDA 含量呈現(xiàn)出降低的趨勢，且與SOD 活性變化趨勢一致，進一步說明了蚯蚓能抑制一部分由ZnO NPs產(chǎn)生的毒害作用，使幼苗的脂質(zhì)過氧化程度降低，證實了蚯蚓對植株生長的促進作用。

3.5 對黃瓜幼苗鋅含量的影響

作為一種新型肥料，ZnO NPs 能顯著提高黃瓜幼苗地上部和地下部的鋅含量，這與現(xiàn)有研究結果一致。Zhang 等[1]在其研究中證明了ZnO NPs 對小麥的鋅強化能力高于普通鋅肥，在乳熟期噴施ZnO NPs，收獲后小麥籽粒鋅含量相比對照提升了44.02%。Du等[3]發(fā)現(xiàn)在盆栽試驗中，ZnO NPs 濃度超過20 mg·kg-1時能顯著提高小麥各組織鋅的含量，當濃度達到1 000 mg·kg-1時，籽粒鋅含量是對照組的3.3倍。然而，在加入蚯蚓后，鋅含量均有所降低。近年來，有研究提出蚯蚓不僅可以通過掘穴活動極大地減少真菌生物量，還可以加速細菌代謝的不穩(wěn)定有機底物的釋放，從而使細菌比例升高，有利于形成以細菌為主導地位的微生物群落[47]。蚯蚓對黃瓜幼苗吸收鋅的影響是否與此種特殊的微生物群落相關，還需進一步研究說明。

4 結論

（1）隨ZnO NPs 處理濃度的增加，蚯蚓組織的鋅含量未產(chǎn)生顯著變化。高濃度處理中，蚯蚓MDA 含量顯著升高，SOD、POD 和CAT 均無顯著差異。表明蚯蚓對ZnO NPs 的響應較低，對高濃度處理耐受性較強。

（2）與對照相比，以500 mg·kg-1為臨界濃度，土施ZnO NPs 對黃瓜幼苗的生長具有低濃度促進、高濃度抑制的效應。當處理濃度高于臨界濃度時，黃瓜幼苗受到氧化損傷。ZnO NPs 能顯著提高植株地上和地下部的鋅含量。

（3）蚯蚓的加入能顯著促進黃瓜幼苗的生長，能在一定程度上抑制或緩解ZnO NPs 對植株的損傷，中、高濃度處理組的MDA 含量表現(xiàn)尤為明顯?？傮w上，ZnO NPs 作為一種新型肥料，能顯著促進幼苗生長，且不會對蚯蚓造成影響。