微塑料對DBP脅迫下生菜光合作用及品質的影響

王成偉，劉禹，宋正國，高敏苓*

（1.天津工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300387；2.汕頭大學工學院，廣東 汕頭 515063）

塑料制品因其制作成本低廉、延展性良好、耐腐蝕、耐用等特點而被廣泛應用于工業(yè)制品、農用地膜和個人護理用品等方面[1-2]。據統(tǒng)計，全球每年消耗大約2.8 億t 塑料[3]。進入水和土壤環(huán)境中的塑料在機械破碎和光降解等作用下裂解成微米或納米級塑料顆粒[4]，從而對環(huán)境生物的生長造成威脅。研究表明，進入海洋水體的微塑料可被水生生物吸收，引起生殖毒性，加劇氧化應激反應，破壞抗氧化防御系統(tǒng)，甚至導致生物體死亡[5-6]。此外，生物體內的微塑料可以通過食物鏈進入人體，對人類健康造成潛在的威脅[7]。Jiang 等[8]發(fā)現(xiàn) 100 nm 的聚苯乙烯（PS）微球可以在蠶豆豆莖根中積累，而且很可能會阻斷運輸營養(yǎng)物質的細胞壁孔。李連禎等[9]通過共聚焦熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)粒徑小于200 nm的PS微球可以被生菜吸收富集，而粒徑為1 000 nm 的PS 微球則不能進入生菜體內，表明微塑料對植物的毒性一定程度上取決于其大小、形狀和種類。

鄰苯二甲酸酯（PAE）主要用于塑料制品和其他工業(yè)產品的生產，以提高塑料制品的韌性、強度及可塑性[10]。全球每年生產的 PAE 大約有 600 萬 t[11]，其已成為全世界使用最廣泛的合成有機化合物[12]。鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）是PAE化合物中極其重要的一種增塑劑，在飲用水、地表水、室內外空氣粉塵、河底沉積物和土壤中頻繁檢出[13-15]。已有研究表明，蔬菜能吸收和積累DBP，從而抑制植物的光合作用、引起氧化損傷、降低生物量，甚至降低作物品質[16]。此外，由于DBP具有致癌性、致畸性和致突變性，其已被美國環(huán)境保護署、中國國家環(huán)境監(jiān)測中心列為環(huán)境優(yōu)先污染物[17-18]。

眾所周知，環(huán)境中絕對意義上的單一污染極少，更多的是多種污染物并存[19]。由于微塑料比表面積大，疏水性和吸附能力強，導致其可能成為各種污染物的理想載體，包括持久性有機污染物、重金屬和病原體等[20-22]。微塑料和PAE 作為兩類重要的污染物，已引起國內外研究者的廣泛關注。因此，探究二者復合污染對高等植物生長和品質的影響，對農業(yè)生產中的污染防治有著重要的意義。本文以綠葉生菜（Lactuca sativaL.var.ramosaHort）為研究對象，采用水培實驗調查兩種不同粒徑的聚苯乙烯微球（100～400 nm，SPS 和10～15 μm，LPS）和DBP 復合污染對生菜幼苗的植物毒性，主要包括：不同粒徑PS和DBP復合污染對生菜光合參數、熒光參數、葉綠素含量和核酮糖-1，5 二磷酸羧化酶（RuBisCo）的影響；復合污染對生菜非酶抗氧化防御系統(tǒng)的影響；復合污染對生菜品質的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

不同粒徑的PS 微球購自于華創(chuàng)化工有限公司（廣東，中國）。色譜甲醇和無水乙醇由賽默菲斯科技有限公司（上海，中國）提供。DBP（99.8%）購自于深圳市萊科科技有限公司（深圳，中國）。酶試劑盒購自科明科技發(fā)展有限公司（蘇州，中國）。

1.2 培養(yǎng)液的配制

用色譜純甲醇將DBP 標準溶液稀釋成濃度為1 000 mg·L-1的儲備液。試驗前，用1/4 Hoagland（霍格蘭氏）營養(yǎng)液將其稀釋至5 mg·L-1。分別將0.125、0.250、0.500 g LPS 和 SPS 加入到 500 mL 1/4 Hoagland營養(yǎng)液中（包含1%的甲醇），配制成濃度為0.25、0.50、1.00 g·L-1的 LPS 和 SPS 溶液，記 為 LPS0.25、SPS0.25、LPS0.5、SPS0.5、LPS1、SPS1。分別將不同濃度的LPS 和SPS 溶液與DBP 溶液混合，制成DBP+LPS0.25、DBP+SPS0.25、DBP+LPS0.5、DBP+SPS0.5、DBP+LPS1、DBP+SPS1 的復合污染溶液。以1/4 Hoagland 營養(yǎng)液處理組作為對照組。在本試驗中，甲醇既是PS溶液的分散劑，也作為DBP的助溶劑，因此設置1%的甲醇處理組以評估甲醇對生菜生長的影響。每個處理設置3 個平行試驗。設置的DBP 和PS 濃度能對生菜生長產生明顯抑制作用，但不會導致其死亡[23-24]。

1.3 試驗設計

綠葉生菜（Lactuca sativaL.var.ramosaHort.）種子用0.02%NaClO 消毒20 min，再用蒸餾水反復洗滌以去除種子表面殘余的NaClO。然后在每個蛭石托盤上播撒數粒、大小均勻一致的種子，將其置于培養(yǎng)箱內發(fā)芽。明暗周期為12 h：12 h，溫度控制在（25±2）℃，相對濕度控制在60%左右。在第二片真葉展開之前，將生菜幼苗由托盤移植到1/4 Hoagland 營養(yǎng)液中，并每3 d 更換一次營養(yǎng)液。當生菜第三片真葉展開后，選取5 株大小一致的幼苗移栽到裝有不同處理液的棕色瓶中，每5 d 補充一次1/4 Hoagland 營養(yǎng)液。為了保持PS 懸浮液均質，每日需將棕色瓶輕輕搖動30 min。培養(yǎng)28 d后，分別收集根和葉樣品用于分析生理生化指標。

1.4 測定項目

1.4.1 光合參數

采收生菜前1 d 的10：00—11：00，利用便攜式光合分析儀（Li-6400，Li-COR，Lincoln，NE，USA）分別測定光合速率（Pn，μmol CO2·m-2·s-1）、氣孔導度（Gs，mol H2O·m-2·s-1）、蒸騰速率（Tr，mmol H2O·m-2·s-1）和胞間CO2濃度（Ci，μmol CO2·mol-1）。分析儀通量密度設置為1 000 mmol·m-2·s-1，蒸汽壓控制在1 kPa，空氣流量設置為500 mmol·s-1，溫度保持在25 ℃，CO2濃度 與 光 強 分 別 控 制 在 458 mmol·m-2·s-1和 1 000 mmol·m-2·s-1。

1.4.2 葉綠素熒光參數

將生菜樣品置于黑暗中30 min，然后使用PAM-2000 葉綠素熒光計（Walz GmbH，Effeltrich，Germany）測定光合系統(tǒng)PSⅡ的光能轉換效率（Fv/Fm）和光合電子傳輸速率（ETR）。

1.4.3 葉綠素含量

取0.2 g 新鮮生菜葉片組織，用去離子水洗凈后置于研缽中，加入1.5 g 碳酸鈣粉末和2 mL 95%乙醇研磨。期間再次加入10 mL 95%乙醇持續(xù)研磨直至樣品呈現(xiàn)無色，研磨后的樣品過濾至25 mL 容量瓶中，并用95%乙醇沖洗數次后移入容量瓶定容。測量前振蕩搖勻試液，用紫外可見分光光度計（UV-1800，島津公司，日本京都）在663 nm 和665 nm 下測量提取物的吸光度。葉綠素a（Ca）和葉綠素b（Cb）含量（mg·g-1FW）計算公式如下：

式中：D663和D645分別代表663 nm 和 645 nm 波長下的吸光度；Ct表示總葉綠素的含量，mg·g-1。

1.4.4 酶活測定

取0.2 g 生菜的葉或根組織作為樣本，用液氮迅速冷凍并研磨成細粉。將樣品轉移至含2 mL 生理鹽水（NaCl，0.9%）的離心管中提取，4 ℃、8 000g離心10 min，將上清轉移至10 mL 的試管中。根據試劑盒說明測定RuBisCo 活性和抗壞血酸（ASA）、谷胱甘肽（GSH）含量。

1.4.5 生菜品質測定

取0.2 g 新鮮的生菜葉片，液氮冷凍并研磨成細粉狀，裝入含有2 mL 提取液的離心管中進行提取。4 ℃、8 000g離心20 min，然后將上清液移入10 mL的試管中。根據試劑盒的說明測定可溶性蛋白含量。

取0.1 g新鮮生菜葉片在1 mL蒸餾水中研磨成勻漿后移入離心管中，并在95 ℃水浴中提取10 min，待冷卻后，在25 ℃、8 000g下分離10 min。根據試劑盒說明測定上清液中的可溶性糖含量。

亞硝酸鹽的測定：在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸反應生成重氮化合物，再與N-1-萘基乙二胺偶聯(lián)反應生成紫紅色化合物，該化合物特征吸收峰在540 nm處測出。

1.5 數據處理

試驗數據均表示為3 次重復的平均值±標準差。采用 Origin 9.1（Originlap Northampton，MA，USA）做圖。使用SPSS（version 23.0，IBM，USA）進行單因素方差分析，P＜0.05表明處理間具有顯著差異。

2 結果與分析

與對照相比，1%甲醇組中生菜光合參數、熒光參數、葉綠素含量、RuBisCo 活性、ASA 和 GSH 含量以及生菜品質等均無顯著差異（P＞0.05），表明1%甲醇對生菜的生長和品質無顯著影響。

2.1 DBP和PS對生菜光合作用的影響

表1 是DBP 和PS 復合污染對生菜光合參數和熒光參數的影響。由表1 可以看出，與對照組相比，DBP 和 LPS（SPS）單一處理組中生菜 Pn、Gs 和 Tr 均顯著降低（P＜0.05），而Ci 的變化趨勢正好相反。例如，LPS1（SPS1）和 DBP 處理導致生菜葉片中 Pn 含量分別降低24.25%（27.57%）和14.00%，Ci 值增加9.23%（11.43%）和5.08%。與單一DBP 污染相比，復合污染顯著降低了生菜的 Pn、Gs 和 Tr，而增加了 Ci（P＜0.05）。如 LPS 的存在使 Pn 較 DBP 降低了 4.63%～17.32%，SPS 存在降低了5.76%～20.35%。熒光參數Fv/Fm和ETR的變化趨勢與Pn一致。

表1 還顯示了不同濃度LPS（SPS）與DBP 脅迫下生菜葉綠素含量的響應。與對照組相比，當PS 濃度為0.5 g·L-1時，Ca和Ct含量顯著降低（P＜0.05）。單一DBP 處理對Ca 和Cb 無顯著影響（P＞0.05），但顯著降低了Ct含量（P＜0.05）。在LPS1（SPS1）與DBP復合處理組中Ca 和Ct 含量最低。例如，與單一DBP 污染相比，LPS（SPS）和 DBP 復合污染導致Ca 含量降低了2.89%～9.05%（3.18%～10.88%），Ct 含 量 降 低 了2.43%～7.41%（2.90%～9.41%）。

2.2 RuBisCo活性對PS和DBP脅迫的響應

圖1 為不同濃度 LPS（SPS）和 DBP 脅迫作用下，生菜體內RuBisCo活性的變化。與對照相比，單一PS脅迫下，生菜葉片中RuBisCo 酶活性明顯受到抑制作用（P＜0.05）；單一DBP 處理組中，生菜葉片RuBisCo酶活性降低了9.01%。與單一DBP處理組相比，LPS1（SPS1）的存在使DBP 脅迫下生菜葉片中RuBisCo 活性顯著下降了24.55%（26.86%）（P＜0.05）。

表1 聚苯乙烯（PS）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）對生菜光合參數、熒光參數和葉綠素含量的影響Table 1 Effects of polystyrene（PS）and di-butyl phthalate（DBP）on photosynthetic and fluorescence parameters and chlorophyll content

2.3 ASA和GSH含量對PS和DBP脅迫的響應

LPS（SPS）和 DBP 脅迫下，生菜葉片和根系內ASA 和 GSH 含量如圖2 所示。在不同濃度 LPS（SPS）脅迫下，生菜細胞內ASA 含量被顯著誘導上升（P＜0.05），而且誘導的程度與PS 濃度劑量成正比（圖2A）。當LPS（SPS）濃度為1 g·L-1時，生菜葉片和根部ASA 含量分別升高了49.55%（51.78%）和50.78%（52.46%）。單一DBP 處理組對生菜體內ASA 含量同樣起到誘導激活效應，激活率為23.65%。與單一DBP處理相比，復合污染顯著提高了生菜葉片和根系中 ASA 含量。當 LPS（SPS）濃度為 1 g·L-1時，復合處理組中生菜葉片和根系ASA 含量分別增加38.64%（38.66%）和40.88%（41.25%）。由此可見，PS 的存在增強了DBP 對生菜ASA 含量的影響。此外，生菜葉片和根系內GSH含量變化趨勢與ASA一致（圖2B）。

2.4 PS和DBP脅迫對生菜品質的影響

LPS（SPS）和DBP 脅迫下生菜葉片內的可溶性蛋白、可溶性糖和亞硝酸鹽含量的變化如圖3 所示。與對照相比，隨著LPS（SPS）濃度的增加，生菜葉片內的可溶性蛋白含量分別顯著降低了3.84%（4.33%）、6.87%（7.89%）和 9.88%（11.65%）（P＜0.05，圖3A）。由此可以看出，SPS 對于生菜葉片內可溶性蛋白含量的影響大于LPS。此外，DBP 單一處理組可溶性蛋白含量相較于對照組降低了5.01%。與單一DBP 處理組相比，LPS1 和SPS1 與DBP 復合污染使可溶性蛋白含量分別下降了10.16%和12.25%。

由圖3B可以看出，LPS0.25（SPS0.25）單一處理組生菜葉片內可溶性糖含量與對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）；當LPS（SPS）濃度為0.5 g·L-1和1.0 g·L-1時，可溶性糖含量顯著小于對照組（P＜0.05），抑制率分別為4.96%（5.97%）和8.21%（10.04%）。與單一DBP 處理組相比，PS 的存在顯著增加了DBP 對可溶性糖的抑制作用（P＜0.05）。

圖3C 表明，隨著 LPS（SPS）濃度增加，生菜葉片中亞硝酸鹽的含量顯著增加（P＜0.05）。如LPS1（SPS1）處理組中，亞硝酸鹽含量較對照組明顯提高49.29%（52.35%）。DBP 單一處理組中亞硝酸鹽含量組增加了20.02%。與DBP 單一處理相比，LPS（SPS）和DBP 復合處理生菜葉片的亞硝酸鹽含量分別增加了 12.74%（13.21%）、29.85%（33.39%）和 53.84%（57.92%）。

3 討論

光合作用通常是指綠色植物通過吸收光能，并利用水和二氧化碳制造有機物，同時釋放氧氣的過程。植物通過光合作用把太陽能轉換并儲存在有機物中，為人類活動提供主要能源[25]。光合抑制也是自然界中植物普遍存在的一種現(xiàn)象，而光合速率降低通常被認為由兩種因素引起，一是由氣孔導度決定的氣孔性限制，二是受細胞內光合活性下降引起的非氣孔性限制[11]。其中氣孔性限制可使Ci降低，而非氣孔性限制則相反。本研究結果顯示，在LPS、SPS及DBP單一及復合脅迫下，生菜細胞內Pn、Gs和Tr均較空白組顯著降低，而Ci 含量則顯著升高，表明光合作用受到抑制是由非氣孔性限制所引起。Fv/Fm 反映葉片的光能轉化效率，通常植物體內PSⅡ反應中心的Fv/Fm值比較穩(wěn)定，不易受到外界干擾。當植物受到環(huán)境脅迫時，F(xiàn)v/Fm 值也會相應降低[26]。本研究中PS 的存在增加了 DBP 對 Fv/Fm 和 ETR 的抑制作用，表明 PS 和DBP的脅迫作用破壞了生菜葉片葉綠體類囊體結構，導致PSⅡ反應中心受到一定程度的損傷，光合的原初反應、光合電子的傳遞過程均受到抑制。本課題組之前的研究也指出聚乙烯和DBP 復合污染抑制了生菜的光合作用[27]。

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，并為地球上的生命活動提供能量來源[26]。通常葉綠素也是顯示高等植物生命力的一個重要特征，環(huán)境脅迫會引起植物葉片葉綠體中色素蛋白脂質復合物的弱化甚至解體，或使與葉綠素分子合成有關的蛋白酶受到限制，進而使葉綠素含量下降[28]。本研究結果表明，與單一DBP 處理組相比，復合污染顯著降低了Ca 和Ct的含量，而且PS 的存在加重了DBP 對Ca 含量的抑制作用。我們推測葉綠素含量下降是由于脅迫作用導致細胞中活性氧的積累，破壞了葉綠素結構，進而影響光合作用[29]。本課題組先前的研究也指出聚乙烯和DBP 復合污染顯著降低了水培生菜的葉綠素含量[27]，這與本研究結果一致。Zhang 等[30]發(fā)現(xiàn)，聚氯乙烯降低了藻類體內葉綠素的含量。Lee 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，微塑料具有較大的比表面積和吸附能力，可能會吸附培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質[31]，影響生菜對氮元素的吸收，從而導致葉綠素合成下降。

RuBisCo 由8 個大亞基和8 個小亞基組成，通常存在于自養(yǎng)細菌和高等植物細胞內，既參與光呼吸途徑又參與光合作用，是進行光合碳同化過程極為重要的一種酶[32]。本研究中，單一的PS 與DBP 脅迫下，生菜細胞內RuBisCo 活性相較于對照組顯著下降，而且PS 的存在加劇了DBP 對RuBisCo 的抑制作用。這可能是因為外源污染物脅迫條件下，生菜體內的自由基過量積累，導致膜脂過氧化，從而抑制RuBisCo 活性，進而干擾葉片葉綠素的合成。類似地，徐曉昀等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在水培條件下，油菜素內脂抑制了黃瓜幼苗體內RuBisCo的活性。

通常情況下，植物體內都有一個較為完善的抗氧化防御體系[34]，當植物受到外界環(huán)境脅迫時，該防御體系能夠清除體內多余且有毒害作用的自由基以降低植物所受到的損傷[35]。而ASA、GSH 作為植物抗氧化系統(tǒng)中的非酶性物質，對于抵御外界脅迫同樣具有重要作用[36-37]。郭偉等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在N-苯基-2-萘胺和鄰苯二甲酸復合作用下，生菜體內的超氧化物岐化酶活性及GSH 含量明顯增加，表明生菜細胞內部產生了應激反應。在ASA-GSH 循環(huán)中，許多抗氧化酶和非酶物質共同清除植物體內積累的過量的活性氧自由基，以提高植物的抗逆性[39]。此外，Caverzan等[34]研究指出，ASA-GSH 循環(huán)存在于細胞質和葉綠體中，在維持蛋白質的穩(wěn)定和生物膜的結構完整性方面也發(fā)揮著重要作用，并能有效防止膜脂過氧化。本研究結果表明，與對照和單一污染相比，PS 和DBP 復合污染顯著增加了對ASA和GSH的刺激作用，這是植物在逆境下的典型應激反應。表明在PS及DBP脅迫作用下，生菜細胞內的ASA-GSH循環(huán)被誘導激活，從而可以清除體內過量的自由基，穩(wěn)定細胞結構。因此，這兩種非酶抗氧化性物質相輔相成，并聯(lián)合植物體內的抗氧化酶共同提高抵抗逆境的能力。

可溶性蛋白作為一種調控物質，在調節(jié)植物體內生理代謝過程中發(fā)揮著重要作用，是衡量生菜品質的重要指標[40]。當植物受到外界脅迫作用時，體內細胞中某些合成蛋白的基因可能會受阻，進而影響可溶性蛋白的合成?？扇苄蕴鞘侵参矬w內的一種營養(yǎng)物質，主要作用是合成纖維素進而促進細胞壁的形成[41]。本研究結果顯示，不同濃度LPS（SPS）的存在顯著加重了DBP 對生菜體內可溶性蛋白與可溶性糖的抑制作用。說明在脅迫處理28 d后，生菜代謝平衡受到破壞，進而使可溶性蛋白和可溶性糖的合成受到抑制，含量顯著下降。楊青青等[42]研究發(fā)現(xiàn)，鉛、鎘復合污染導致小白菜可溶性蛋白含量顯著下降。此外，可溶性糖也是光合作用的主要產物[43]。PS 的存在加劇了DBP對生菜RuBisCo活性的抑制，降低了葉綠素含量，從而導致生菜的光合作用受到抑制。因此認為，光合作用降低也是導致生菜可溶性糖含量下降的重要原因。Li等[44]認為PS被蔬菜吸收后，其在葉片中降解產生的苯是導致葉綠素代謝和糖代謝受到抑制的主要原因，但這還需要進一步的研究驗證。

亞硝酸鹽作為一種有毒物質，其在酸性條件下，可與次級胺生成具有致癌作用的亞硝胺[45]。含有過量硝酸鹽或亞硝酸鹽的蔬菜被人體食用后，可能會氧化人體血紅蛋白中的Fe2+，進而降低體內輸氧能力，嚴重時會造成急性中毒[46]。本研究結果表明，單一PS 或DBP 污染明顯增加了生菜葉片中亞硝酸鹽的含量，且隨著PS 濃度增加顯著提高（P＜0.05）。與單一DBP 污染相比，復合污染進一步增加了生菜葉片中亞硝酸鹽的含量。推測可能是因為在不同濃度LPS（SPS）和DBP 脅迫下，生菜細胞內的硝酸鹽還原酶含量增加所致[47]。根據國內對食品安全國家標準（GB 2762—2017）規(guī)定，蔬菜及其制品中亞硝酸鹽的含量應低于20 mg·kg-1，農業(yè)行業(yè)標準（NY/T 437—2012）規(guī)定，蔬菜中的亞硝酸鹽含量不超過4 mg·kg-1。本研究中，LPS1+DBP 和 SPS1+DBP 處理中生菜葉片中亞硝酸鹽含量最高，分別為2.62 mg·kg-1和2.69 mg·kg-1，雖然滿足國家食品安全標準和農業(yè)行業(yè)標準要求，但顯著高于對照（1.42 mg·kg-1）和單一DBP 處理組（1.70 mg·kg-1）。因此，PS 和 DBP 復合污染增加了人類暴露亞硝酸鹽的風險。已有研究指出，當維生素C 與亞硝酸鹽的比例達到2∶1 時，可以通過阻斷N-亞硝基化合物形成，進而消除亞硝酸鹽的負面影響[48]。但在本研究中Vc（ASA）與亞硝酸鹽的比例遠低于2∶1，因此生菜中的Vc無法完全消除亞硝酸鹽的影響。

無論在單一污染還是復合污染中，SPS 與LPS 對生菜光合作用和品質的影響無顯著差異。這可能是因為在培養(yǎng)液中SPS更容易發(fā)生團聚，從而導致其動力學直徑增加[49]。因此，微塑料團聚體只能附著在根系表面，造成物理性阻塞，從而影響生菜對養(yǎng)分和水分的吸收[24]。Bosker 等[24]發(fā)現(xiàn)，不同粒徑的微塑料（50、500、4 800 nm）對水芹的根系生長和發(fā)芽率無顯著影響。而有研究表明，較小粒徑的微塑料對作物有顯著的毒性效應[8-9]。這表明微塑料的毒性取決于微塑料的粒徑、濃度、形狀和作物的品種等，具體機制有待進一步研究。

4 結論

（1）PS的存在加劇了DBP對生菜幼苗RuBisCo活性和葉綠素合成的抑制作用，導致光合作用降低。

（2）雖然生菜體內抗氧化防御系統(tǒng)非酶物質ASA和GSH 含量增加，但仍引起生菜品質的下降，說明PS的存在加重了DBP 對生菜的毒性效應，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

（3）大粒徑PS 與小粒徑PS 對生菜毒性效應無顯著差異。