枸杞多糖的制備及藥理作用研究進(jìn)展

馬敏潮，鄒登朗，陳成標(biāo)，祁得勝，馬建濱，都玉蓉

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 青海省青藏高原生物多樣性形成機(jī)制與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008)

枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科枸杞屬中的多分枝灌木植物。為傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥，具有明目養(yǎng)肝、益精補(bǔ)腎等多種功效，對于目眩頭暈、肝部陰虛、腰膝酸軟、虛勞咳嗽、消渴遺精等多種病癥都有特殊功效[1]。早在2300年前，中國醫(yī)學(xué)專著記載了枸杞的藥用價(jià)值，枸杞可用來生產(chǎn)各種健康產(chǎn)品和食物，例如藥用飲料和飲品，以及藥膳[2]。枸杞果實(shí)呈紅色，味道甜美，生長于我國北部地區(qū)，尤其是寧夏回族自治區(qū)中。青海省枸杞種植始于20世紀(jì)的60年代，種植地區(qū)主要集中在柴達(dá)木盆地的格爾木、都蘭、烏蘭等地區(qū)，平均海拔3 000 m，年平均降水量為177 mm，集中在5～9月。該地區(qū)具有強(qiáng)輻射、長日照、低濕度、晝夜溫差大等獨(dú)特氣象條件，是典型的高原大陸性氣候[3]。柴達(dá)木產(chǎn)區(qū)內(nèi)的枸杞具有果實(shí)碩大、顏色鮮艷、肉厚籽少、含糖量高、大小均勻等特點(diǎn)，已成為我國高產(chǎn)，質(zhì)優(yōu)枸杞產(chǎn)區(qū)之一，暢銷國內(nèi)外市場。

枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是枸杞中提取出的一種多糖復(fù)合體，也是枸杞多種活性成分當(dāng)中最主要的一種。枸杞多糖中最常見的六種單糖為：甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖[4]。枸杞多糖對治療肝炎、糖尿病、高血脂癥、血栓和免疫缺陷等多種疾病具有生物學(xué)和藥理學(xué)活性，此外，枸杞多糖還具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化等功效[5]。枸杞多糖現(xiàn)如今已成為保健食品中重要的添加劑，具有深遠(yuǎn)的研究意義以及廣闊的市場前景。

1 枸杞多糖的制備方法

枸杞多糖的提取方式多樣，有熱水浸提、微波及超聲波輔助提取、酶法提取、高速剪切技術(shù)輔助提取等。提取出的枸杞粗多糖當(dāng)中還含有蛋白質(zhì)、脂肪、色素等非糖雜質(zhì)，需對其采用多種方法進(jìn)行分離純化除去里面的雜質(zhì)，最終得到化學(xué)組分、結(jié)構(gòu)、聚合度都相同的單一多糖組分[6]。

1.1 粗枸杞多糖的制備

1.2 枸杞粗多糖的分離純化

1.2.1 Sevag法脫蛋白 Li X. M.[2]將枸杞干果粉末，熱水提取后得到的提取液通過Sevag方法濃縮和脫蛋白，之后用流動(dòng)的蒸餾水充分透析2 d，將滲余物在減壓濃縮后醇沉，并在40 ℃下真空干燥，得到枸杞多糖，發(fā)現(xiàn)其由鼠李糖，木糖，阿拉伯糖，巖藻糖，葡萄糖和半乳糖苷組成，并通過糖苷鍵連接在一起。Long X. Y.等人[15]使用超臨界二氧化碳萃取制得的枸杞漿果，將其用10倍體積的熱水在80 ℃進(jìn)行提取、減壓濃縮后，采用單因素并結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)方法考察原料與水提物濃縮之比(0.25～0.10g/mL)、氯仿與正丁醇之比(1.0～5.0mL/mL)、水提物濃縮液與Sevag試劑之比(0.3～1.5mL/mL)對于枸杞多糖和殘留蛋白含量的影響。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，最佳脫蛋白工藝為：原料與水提物濃縮之比0.15g/mL、氯仿與正丁醇之比2.17mL/mL、水提物濃縮液與Sevag試劑之比0.50mL/mL。

1.2.2 枸杞多糖的分離 郭琦[7]使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)對枸杞粗多糖水溶液進(jìn)行處理后，通過不同濃度的鹽溶液及酸溶液調(diào)節(jié)pH值，再醇沉分離得枸杞多糖。王博等人[16]在枸杞中加入8倍體積的水回流提取2 h，過濾得第一汁；濾渣中加入6倍體積的水再次回流提取1.5 h，過濾得第二汁；以上兩種濾液的一半混合得合并液。采用GQ145高速管式分離機(jī)和膜分離設(shè)備對三種濾液進(jìn)行處理，去除其中的無機(jī)小分子，經(jīng)過苯酚-硫酸法測定最終發(fā)現(xiàn)枸杞多糖含量在第一汁中為15.51%、第二汁中為8.36%、合并液中為14.24%。周立爽[12]將LBP1離心后取上清，將其置于DEAE Sepharose TM Fast Flow柱中，用超純水和不同濃度的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，合并洗脫出來的相同組分通過減壓濃縮、透析、真空冷凍干燥得0.05 M的組分LBP1A1、0.1 M的組分LBP1B和0.2M的組分LBP1C。

1.2.3 枸杞多糖的純化與結(jié)構(gòu)鑒定 趙孟欣等人[17]采用Sevag法對枸杞水提液去除蛋白質(zhì)，使用活性炭去除色素，再通過減壓濃縮、透析及冷凍干燥的方法得到純化枸杞多糖。枸杞多糖經(jīng)過1-苯基3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化后，使用高效液相色譜分析，最終確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室自制的4個(gè)產(chǎn)地枸杞多糖中都含甘露糖、果糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和脫氧核糖。文沛瑤等人[18]將枸杞水提液濃縮后，進(jìn)行三相萃取法和醇沉法來純化枸杞多糖，通過正交試驗(yàn)確定三相萃取法條件，當(dāng)提取液中(NH4)2SO4為30%、叔丁醇量為10 mL、溫度為35 ℃、pH為6，提取率可以達(dá)到95.31%。上述兩種多糖經(jīng)過紅外光譜檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基本相同。

2 枸杞多糖的藥理作用

2.1 免疫作用

Song S. Q.[19]等人通過檢測枸杞多糖對缺氧和葡萄糖剝奪損傷的功能以及大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株(PC-12)細(xì)胞的潛在機(jī)制時(shí)，得出枸杞多糖通過上調(diào)內(nèi)源性非編碼小分子RNA-12(miR-12)水平并激活OGD誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞中的Wnt/β-Catenin信號通路和JAK1/STAT3途徑發(fā)揮預(yù)防作用。黃潔等人[20]使用不同濃度枸杞多糖和光照強(qiáng)度對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)進(jìn)行不同作用時(shí)間處理建立ARPE-19細(xì)胞損傷模型，通過MTT法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)印記法檢測PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明枸杞多糖對于ARPE-19具有保護(hù)作用，持續(xù)光照可顯著降低ARPE-19細(xì)胞的活力以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，枸杞多糖使得細(xì)胞活力上升，隨濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也逐漸下降。

2.2 抗氧化作用

魏芬芬等人[21]通過讓昆明小鼠疲勞游泳建立小鼠疲勞模型，同時(shí)給小鼠灌胃枸杞多糖，實(shí)驗(yàn)28d。結(jié)果表明：枸杞多糖能夠增加機(jī)體中糖原儲(chǔ)備量，加快自由基、乳酸等的清除，對疲勞有一定的緩解作用。王彩霞[22]采用雌性昆明小鼠分成正常組、模型組、枸杞多糖低、中、高劑量組5組，后4組小鼠頸背部注射D-半乳糖建立小鼠亞急性衰老模型，正常組小鼠注射相同體積生理鹽水，造模期間給枸杞多糖低、中、高劑量組灌胃枸杞多糖，模型組、正常組灌胃相同體積生理鹽水，連續(xù)42 d。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，LBP可以清除衰老模型小鼠體內(nèi)氧自由基及其代謝產(chǎn)物，提高抗氧化能力，改善機(jī)體過氧化損傷，具有一定延緩衰老的作用。

2.3 抗腫瘤作用

韓何丹等人[23]使用枸杞多糖順鉑聯(lián)合處理氧化損傷的A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)，檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度及抗氧化指標(biāo)，WB法細(xì)胞檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)等，最終發(fā)現(xiàn)LBP與(順鉑)DDP的聯(lián)合作用可明顯促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，其機(jī)制主要與兩者對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。Gong G. P.等人[24]通過免疫熒光染色、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)對比了實(shí)驗(yàn)室自制枸杞多糖組分對肝癌細(xì)胞(SMMC-7721和HepG2)、宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、胃癌細(xì)胞(SGC-7901)和人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)生長的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化后的枸杞多糖對MCF-7細(xì)胞的抑制性要強(qiáng)于SMMC-7721細(xì)胞(細(xì)胞活力：78.91%)和HeLa細(xì)胞，對HepG2和SGC-7901細(xì)胞無影響。

2.4 降糖降脂作用

Adnan J.M. Al-Fartosy[25]使用四氧嘧啶對小鼠進(jìn)行腹腔注射來建立糖尿病模型，同時(shí)灌胃枸杞多糖，檢測血糖、尿素、肌酐、堿性磷酸酶(ALP)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和總蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過枸杞多糖可以維持血糖水平和體重的平衡，提高自由基清除率，改善血清胰島素、高脂血癥和肝腎功能受損。趙蕊[26]通過實(shí)驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)枸杞多糖可以降低MDA水平，提高SOD、過氧化氫酶(CAT)、GSH等水平，可以改善非胰島素依賴型糖尿病大鼠胰腺、肝臟和腎臟的損傷，控制其體重、血糖、血脂和修復(fù)DNA損傷，且具有良好的抗氧化活性。

2.5 生殖方面

Liu B.等人[27]通過為小鼠注射孕母馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)建立小鼠卵巢損傷模型，同時(shí)給小鼠灌胃枸杞多糖，研究其對小鼠反復(fù)超排卵所致卵巢損傷的修復(fù)作用，發(fā)現(xiàn)枸杞多糖最有可能通過清除氧化產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷和脂質(zhì)過氧化物并增加抗中腎管激素蛋白表達(dá)來修復(fù)卵巢損傷。高悅等人[28]通過對孕鼠飼喂添加了全氟辛酸(PFOA)的飼料，同時(shí)灌胃不同濃度的枸杞多糖，檢測了孕鼠檢測卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)和雌激素(E2)的含量。實(shí)驗(yàn)證明，枸杞多糖具有清除氧自由基、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控表觀遺傳修飾等作用，且可以改善全氟辛酸導(dǎo)致的子代雌鼠的生殖損傷。Ren F.等人[29]在山羊精子擴(kuò)展劑中分別加入不同濃度的枸杞多糖與海帶多糖，檢測精子個(gè)數(shù)、能動(dòng)性、細(xì)胞膜及頂體完整性，測定SOD、CAT和GSH-Px的活性以及人工受精后的妊娠率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枸杞多糖和海帶多糖通過增強(qiáng)抗氧化活性來保護(hù)山羊精子免受低溫?fù)p傷，可提高精子活力、頂體和細(xì)胞膜完整性、線粒體活性、抗氧化活性，說明枸杞多糖和海帶多糖對山羊精子的冷凍都具有強(qiáng)保護(hù)作用。

3 結(jié)語與展望

如今，人們在枸杞多糖的提取、分離、純化以及結(jié)構(gòu)鑒定等方面的研究都取得了良好的進(jìn)展。但是，還仍需要在提取條件優(yōu)化、節(jié)約成本、提高效率、縮短時(shí)間等方面做更多的工作。目前，對于枸杞多糖生理功能的研究，大多集中在其抗氧化、免疫、抗疲勞、抑癌作用等方面，枸杞多糖還具有其他多種生理功能，需要人們繼續(xù)進(jìn)行深入的挖掘探索。隨著枸杞多糖被廣泛應(yīng)用于藥品、化妝品、功能性食品等各個(gè)領(lǐng)域，開發(fā)出新型的枸杞相關(guān)產(chǎn)品，是極其必要的。青海柴達(dá)木枸杞品質(zhì)優(yōu)良，加大對其研究力度，可以為當(dāng)?shù)罔坭郊拌坭蕉嗵堑拈_發(fā)利用提供理論依據(jù)，并且能夠提高種植地區(qū)的經(jīng)濟(jì)水平，對于當(dāng)?shù)馗鱾€(gè)方面的發(fā)展具有重要意義。