耐多藥肺結(jié)核患者外周血中性粒細(xì)胞抗結(jié)核活性的初步研究

劉婷 王亮 楊梅

中性粒細(xì)胞[neutrophil；又稱多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)]是控制結(jié)核病所必須的固有免疫細(xì)胞[1]，近年來(lái)在抗結(jié)核感染中的作用越來(lái)越受到關(guān)注，但作用機(jī)制并不十分明朗。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)可以通過(guò)與PMN表面的Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)結(jié)合而活化TLR2，從而啟動(dòng)吞噬和殺傷效應(yīng)，參與PMN的凋亡過(guò)程，故阻斷MTB與TLR2的結(jié)合可降低結(jié)核病患者的PMN凋亡率[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，耐藥肺結(jié)核患者外周血PMN培養(yǎng)上清液中的TLR2水平明顯低于非耐藥患者[3]。因此，推測(cè)TLR2表達(dá)水平的下調(diào)可能促進(jìn)了吞噬MTB的PMN的自身凋亡，使其不能有效清除吞噬體內(nèi)的MTB，導(dǎo)致MTB耐藥。為進(jìn)一步探索PMN在MTB耐藥機(jī)制中的作用，筆者建立了體外MTB抗原-PMN(MTB-Ag-PMN)感染模型，以觀察耐多藥肺結(jié)核患者的PMN是否存在凋亡抑制。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

1.菌株來(lái)源：搜集2017年5月至2018年9月就診于深圳市寶安區(qū)慢性病防治院并確診的10例耐多藥肺結(jié)核患者(耐多藥組)和10例藥物敏感肺結(jié)核患者(非耐藥組)，分別獲取其MTB臨床分離株并凍存。菌株均于患者在抗結(jié)核藥品干預(yù)前進(jìn)行比例法藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)確證，耐多藥MTB臨床分離株至少對(duì)利福平和異煙肼耐藥；非耐藥MTB臨床分離株對(duì)利福平和異煙肼均敏感。

2.患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡范圍為18～50歲者；(2)初診；臨床癥狀典型，且臨床癥狀符合肺結(jié)核臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)胸部X線攝影或CT檢查為疑似肺結(jié)核者；(3)痰抗酸桿菌涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)任一陽(yáng)性，且有GeneXpert MTB/RIF耐藥檢測(cè)結(jié)果者；(4)排除患自身免疫性疾病、惡性腫瘤、其他慢性感染(如慢性乙型或丙型病毒性肝炎、HIV感染等)、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等疾病者，以及妊娠及哺乳期婦女。

二、研究方法

1.儀器與試劑: PMN分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限公司，完全RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，臺(tái)盼藍(lán)染液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)分光光度法檢測(cè)試劑盒和Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，TLR2-ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份公司，MB-580型酶標(biāo)儀和PW-960G型洗板機(jī)購(gòu)自深圳匯松科技發(fā)展公司，CKX41熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯株式會(huì)社。

2.MTB抗原制備:將凍存的MTB菌株復(fù)蘇成功，再使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，重懸于PBS中。80 ℃加熱1 h滅菌，用PBS調(diào)整細(xì)菌濃度為1×106個(gè)/ml，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩４司鷳乙杭春蠱TB抗原，分別為耐多藥MTB抗原(RMTB)和非耐藥MTB抗原(SMTB)。

3.PMN的分離：分別抽取患者外周血6 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法分離出PMN[分別為耐多藥PMN(RPMN)和非耐藥PMN(SPMN)]，立即用完全RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液清洗并調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。再通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色和瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色形態(tài)學(xué)檢查來(lái)驗(yàn)證PMN的活力和純度，均>95%即為分離成功。

4.PMN細(xì)胞凋亡的相關(guān)檢測(cè)：體外建立MTB-Ag-PMN感染模型。操作方法(以1例患者為例)：吸取1 ml上述PMN，分別接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的3孔，2 h后向其中2孔中加入上文制備的耐多藥或非耐藥MTB抗原各1 ml，則形成6種組合，即耐多藥組：RPMN組、RPMN+RMTB組、RPMN+SMTB組；非耐藥組：SPMN組、SPMN+RMTB組、SPMN+SMTB組；其中，RPMN組和SPMN組為空白對(duì)照組，且調(diào)整PMN和MTB抗原濃度為1×106個(gè)/ml和5×106個(gè)/ml[4]。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集各組PMN，調(diào)整其細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，再使用Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組PMN的凋亡率和PMN的凋亡指標(biāo)(Caspase-3)的活化程度；同時(shí)收集PMN培養(yǎng)上清液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組PMN中另一凋亡指標(biāo)TLR2的濃度水平。其中，PMN的凋亡率為熒光倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)PMN細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)的百分率(%)；Caspase-3的活化程度為酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)時(shí)測(cè)定的吸光度值(A值)，各孔A值與陰性對(duì)照孔A值(試劑盒中自帶陰性對(duì)照)的倍數(shù)(即：A各孔/A陰性對(duì)照)即為各孔Caspase-3的活化程度；TLR2的濃度水平為酶標(biāo)儀自動(dòng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的工作液匯制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)將450 nm波長(zhǎng)時(shí)測(cè)量的各孔A值換算成濃度值(ng/ml)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組PMN的凋亡率

RPMN+RMTB組、RPMN+SMTB組、RPMN組、SPMN+RMTB組、SPMN+SMTB組和SPMN組的PMN凋亡率分別為(21.74±3.35) %、(34.66±3.05) %、(30.67±3.03) %、(33.56±2.94) %、(50.84±3.38) %和(36.54±2.49) %。為研究MTB對(duì)耐藥組與非耐藥組PMN凋亡的影響，本研究發(fā)現(xiàn)RPMN組PMN的凋亡率明顯低于SPMN組，但高于RPMN+RMTB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.728和 6.254，P值均為0.000)；而RPMN+RMTB組明顯低于SPMN+SMTB組，也明顯低于RPMN+SMTB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為16.699和9.018，P值均為0.000)；SPMN+SMTB組明顯高于SPMN+RMTB組，也明顯高于SPMN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為12.200和8.974，P值均為0.000)。

二、耐多藥組與非耐藥組PMN的Caspase-3與TLR2水平(表1)

表1 不同MTB抗原對(duì)耐多藥和非耐藥肺結(jié)核患者PMN的Caspase-3活化程度及TLR2水平的影響

(一)Caspase-3的活化程度

1.組內(nèi)比較：無(wú)論有無(wú)MTB抗原刺激，耐多藥組內(nèi)3組間的Caspase-3活化水平均未見(jiàn)差異(F=0.124，P=0.884)；其中RPMN組與RPMN+RMTB組、RPMN+SMTB組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。非耐藥組內(nèi)3組間的Caspase-3活化水平比較，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.384，P=0.111)；其中SPMN組與SPMN+SMTB組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但與SPMN+RMTB組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.組間比較：RPMN組的Caspase-3活化水平明顯低于SPMN組，RPMN+RMTB組明顯低于SPMN+SMTB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為t=5.224，P=0.000；t=3.063，P=0.007)。

(二)TLR2水平

1.組內(nèi)比較：無(wú)論有無(wú)MTB抗原刺激，耐多藥組內(nèi)3組間的TLR2水平均未見(jiàn)差異(F=3.245，P=0.055)；其中RPMN組的TLR2與RPMN+RMTB比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與RPMN+SMTB組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。非耐藥組內(nèi)3組間的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.445，P=0.000)，且SPMN組明顯高于SPMN+RMTB組，但明顯低于SPMN+SMTB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

2.組間比較：RPMN組的TLR2水平明顯低于SPMN組，RPMN+RMTB組明顯低于SPMN+SMTB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為t=14.931，P=0.000；t=11.297，P=0.000)。

討 論

MTB并不能產(chǎn)生任何內(nèi)外毒素或是侵襲性酶，所引起的病理改變主要是機(jī)體對(duì)MTB感染后產(chǎn)生的病理免疫反應(yīng)[5-6]。PMN是MTB感染后最早侵入的局部組織細(xì)胞，也是肺結(jié)核患者氣道中數(shù)量最多的細(xì)胞。研究表明，在MTB感染初期，PMN在對(duì)病原體的吞噬、細(xì)胞凋亡和下游免疫反應(yīng)的激活中表現(xiàn)出顯著的免疫抗性[7]。還有研究認(rèn)為，PMN可能參與了MTB感染導(dǎo)致的組織免疫損傷和慢性感染的活化過(guò)程，且能有效引起MTB潛伏感染[8]，但PMN在MTB感染中的具體作用仍待發(fā)掘。

本研究中，筆者構(gòu)建了非耐藥和耐多藥MTB體外MTB-Ag-PMN感染模型，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)MTB抗原刺激的RPMN組PMN的凋亡率明顯低于SPMN組，提示耐多藥肺結(jié)核患者的PMN在體內(nèi)的凋亡能力已明顯弱于非耐藥患者；但明顯高于RPMN+RMTB組的凋亡率，提示耐多藥肺結(jié)核在耐多藥MTB抗原的再次刺激下，其PMN的凋亡能力較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)進(jìn)一步降低，說(shuō)明耐多藥MTB抗原對(duì)耐多藥患者PMN的凋亡有抑制作用。而SPMN+SMTB組PMN的凋亡率明顯高于RPMN+RMTB組的凋亡率，說(shuō)明耐多藥肺結(jié)核患者的PMN在受到耐多藥MTB抗原刺激后較非耐藥患者存在明顯的凋亡抑制，與Romero 等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)感染耐藥MTB標(biāo)準(zhǔn)株后，會(huì)激活促分裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)，并使其活性下降，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS)產(chǎn)物，導(dǎo)致PMN凋亡抑制的結(jié)果類似。

本研究還顯示，SPMN+SMTB組的PMN的凋亡率也明顯高于SPMN組，說(shuō)明非耐藥MTB抗原對(duì)非耐藥肺結(jié)核患者PMN的凋亡有促進(jìn)作用，可以幫助PMN更好地殺傷吞噬在內(nèi)的MTB。同時(shí)，RPMN+SMTB組PMN的凋亡率也明顯高于RPMN+RMTB組，而SPMN+RMTB組PMN的凋亡率明顯低于SPMN+SMTB組，提示非耐藥MTB抗原可以提高耐藥患者PMN的凋亡率，而耐多藥MTB抗原會(huì)降低非耐藥患者PMN的凋亡率，說(shuō)明耐多藥MTB抗原對(duì)耐多藥和非耐藥患者都存在PMN凋亡的抑制作用，而非耐藥MTB抗原對(duì)耐多藥患者PMN存在凋亡促進(jìn)作用。

PMN主要通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognize receptor，PRR)介導(dǎo)直接識(shí)別MTB，其中TLR2發(fā)揮著重要作用[10]。TLR2是一種主要分布于PMN等抗原提呈細(xì)胞表面的PRR，在PMN吞噬MTB后，MTB可以在p38 MAPK信號(hào)通路持續(xù)磷酸化的作用下，刺激TLR2而增強(qiáng)ROS產(chǎn)物，再通過(guò)Caspase途徑觸發(fā)PMN凋亡[11-12]。而早年在對(duì)MTB引起人免疫細(xì)胞的凋亡研究中就發(fā)現(xiàn)，PMN發(fā)生自發(fā)凋亡時(shí)伴有Caspase-3的激活，而MTB誘導(dǎo)PMN凋亡會(huì)明顯增加Caspase-3的激活程度和速度[13]。這提示宿主可通過(guò)TLR2和Caspase介導(dǎo)感染部位的PMN凋亡來(lái)清除其吞噬的MTB，從而建立使炎癥局限的重要的防御機(jī)制。在前期研究中，筆者課題組發(fā)現(xiàn)耐多藥肺結(jié)核患者外周血中PMN的TLR2水平明顯低于非耐藥患者[3]。本次研究進(jìn)一步證實(shí)了MTB耐藥的機(jī)制之一可能與患者PMN表面TLR2的表達(dá)下調(diào)有關(guān)，從而影響到PMN的自身凋亡，使其不能有效清除吞噬體內(nèi)的MTB。

同時(shí)，筆者也觀察了各組PMN與相應(yīng)MTB抗原在體外共培養(yǎng)后，PMN的TLR2水平及Caspase-3的活化程度。首先發(fā)現(xiàn)不僅未經(jīng)MTB抗原刺激的SPMN組PMN 的TLR2 及Caspase-3水平高于RPMN組，而且發(fā)現(xiàn)經(jīng)MTB抗原刺激的SPMN+SMTB組PMN的TLR2和Caspase-3水平也明顯高于RPMN+RMTB組。筆者推測(cè)，PMN凋亡率的下降與TLR2表達(dá)減少及Caspase-3活化程度減弱可能存在一定關(guān)系。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，SPMN+RMTB組的TLR2水平明顯低于SPMN組，而SPMN+SMTB組的TLR2水平明顯高于SPMN組，說(shuō)明耐多藥MTB抗原可能會(huì)下調(diào)非耐藥患者PMN的TLR2水平，而非耐藥MTB抗原可能會(huì)上調(diào)非耐藥患者PMN的TLR2水平。本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然SPMN組Caspase-3的活化程度明顯高于RPMN組，且除SPMN+RMTB組Caspase-3的活化程度低于SPMN組外，無(wú)論是耐多藥還是非耐藥患者，在耐多藥MTB抗原或非耐藥MTB抗原刺激后，其PMN的Caspase-3活化程度均與未受MTB抗原刺激的空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。分析原因，可能是PMN離體培養(yǎng)后功能受損，無(wú)法對(duì)MTB抗原刺激作出良好反應(yīng)，也可能是抑制耐多藥肺結(jié)核患者PMN的凋亡并非完全通過(guò)Caspase-3的活化程度表現(xiàn)出來(lái)，期望在下一步的實(shí)驗(yàn)中加以探索。

綜上，本研究初步對(duì)耐多藥肺結(jié)核患者PMN的抗結(jié)核免疫功能進(jìn)行了探索，證實(shí)了經(jīng)耐多藥MTB抗原再次刺激的PMN的凋亡率、TLR2水平和Caspase-3活化程度確實(shí)明顯低于非耐藥MTB抗原的作用，且這種抑制作用會(huì)降低清除吞噬細(xì)胞內(nèi)耐藥MTB的有效性，認(rèn)為耐多藥肺結(jié)核患者體內(nèi)確實(shí)存在PMN的凋亡抑制，導(dǎo)致耐多藥MTB在PMN中持續(xù)生長(zhǎng)繁殖、逃避宿主的非特異性免疫，且這種抑制作用可能與TLR2水平的下調(diào)和Caspase-3活化程度的降低存在一定的關(guān)系。這可能是耐多藥MTB的耐藥免疫學(xué)機(jī)制之一，但對(duì)于具體的相關(guān)免疫分子和信號(hào)傳導(dǎo)通路尚未可知，還有待進(jìn)一步研究。