結(jié)核病患者外周血γ干擾素釋放試驗(yàn)假陰性的相關(guān)因素分析

俞珊 李志明 許春霞 王濤

外周血γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assay，IGRA)是一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的免疫診斷技術(shù)。檢測(cè)原理是人體感染結(jié)核分枝桿菌后，產(chǎn)生記憶性T淋巴細(xì)胞，當(dāng)特異性結(jié)核抗原再次入侵時(shí)，記憶細(xì)胞就會(huì)迅速增殖活化形成大量的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，釋放γ-干擾素(IFN-γ)。IGRA通過測(cè)定IFN-γ或能夠釋放IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞來判斷體內(nèi)是否存在結(jié)核分枝桿菌感染[1]。錢宏波等[2]研究表明，IGRA對(duì)結(jié)核感染檢測(cè)的敏感度為81.7%～97.1%，特異度為75.2%～95.6%。臨床上有一部分患者雖然從痰液或膿液涂片中能夠找到抗酸桿菌，或者通過分子生物學(xué)、病理學(xué)能夠明確診斷為結(jié)核病，但是其外周血IGRA檢測(cè)為陰性。本研究收集2018年1月至2020年3月解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心結(jié)核四科收治的診斷明確、資料完整的38例外周血IGRA檢測(cè)陰性結(jié)核病患者的資料，與同期收治的119例IGRA檢測(cè)陽性結(jié)核病患者的資料進(jìn)行對(duì)照，分析可能導(dǎo)致外周血IGRA檢測(cè)假陰性的影響因素。

資料和方法

一、資料收集

1. 研究對(duì)象： 2018年1月至2020 年 3月解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心收治的符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，資料完整的157例結(jié)核病患者。

2. 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～70歲；(2)結(jié)核病診斷明確：符合中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布的《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]和《WS 196—2017結(jié)核病分類》[4]：通過標(biāo)本抗酸染色、分子生物學(xué)、培養(yǎng)或病理明確診斷為結(jié)核病患者。

3. 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)并發(fā)免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病或腫瘤；(2)進(jìn)行骨髓或器官移植；(3)長期大量使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑；(4)標(biāo)本培養(yǎng)或菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌；(5)存在心、肺、腦、肝、腎嚴(yán)重?fù)p傷；(6)孕期或哺乳期婦女；(7)HIV感染者及 AIDS 患者；(8)未收集到完整資料。

4. 分組情況：按照IGRA檢測(cè)結(jié)果分為IGRA假陰性組和IGRA陽性組。最終納入結(jié)核病患者157例，其中IGRA假陰性組38例，IGRA陽性組119例。

二、納入患者一般資料

157例患者中，男102例，女55例；年齡中位數(shù)(四分位數(shù))“M(Q1，Q3)”44.0(29.0，58.0)歲，病程M(Q1，Q3) 3.0(1.1，7.0)個(gè)月。IGRA假陰性組38例，其中，男24例，女14例，年齡M(Q1，Q3) 46.5(29.5，63.2)歲，病程M(Q1，Q3) 3.5(1.0，7.8)個(gè)月。IGRA陽性組119例，其中，男78例，女41例，年齡M(Q1，Q3) 42.0(29.0，56.0)歲，病程M(Q1，Q3) 3.0(1.1，7.0)個(gè)月。兩組患者性別、年齡、治療史、采血前抗結(jié)核治療時(shí)間、病灶部位、耐藥情況、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史、結(jié)核抗體檢測(cè)等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(表1)。

續(xù)表1

三、檢測(cè)方法

收集確診患者本次住院治療前外周血IGRA、CA125、血紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和T細(xì)胞亞群結(jié)果。

1. IGRA檢測(cè)：采用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的血IGRA測(cè)定試劑盒(體外釋放酶聯(lián)免疫吸附法)檢測(cè)外周血IGRA。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：按照試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)測(cè)試分為“N-陰性孔”“T-檢測(cè)孔”“P-陽性孔”3個(gè)孔。N孔檢測(cè)體內(nèi)基礎(chǔ) IFN-γ含量，T孔檢測(cè)經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激全血后，被結(jié)核分枝桿菌感染的特異性T細(xì)胞釋放的IFN-γ含量，P孔檢測(cè)植物血凝素(PHA)非特異性刺激全血中T細(xì)胞釋放的IFN-γ含量，當(dāng)T 管與N 管含量差值(T-N)≥14且≥N/4 時(shí)，結(jié)果判定為陽性；當(dāng)T-N<14時(shí)，結(jié)果判定為陰性。

2. CA125檢測(cè)：采用美國貝克曼庫爾特UniCel DxI 800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)CA125在血清中的濃度(正常參考值：0～35 U/L)。

3. ESR檢測(cè)：采用魏氏法檢測(cè)ESR(正常參考值：0～20 mm/1 h)。

4. CRP檢測(cè)：采用美國貝克曼庫爾特AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)CRP在血漿中的濃度(正常參考值：0～4 mg/L)。

5. T細(xì)胞亞群檢測(cè)：采用美國貝克頓-迪金森公司分選式流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血 T細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T/CD8+T、自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T，NKT細(xì)胞)、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)及B細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分比(正常參考值：T細(xì)胞計(jì)數(shù)966～2860個(gè)/μl，T細(xì)胞百分比0.50～0.84，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)550～1440個(gè)/μl，CD4+T細(xì)胞百分比0.27～0.51，CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)320～1250個(gè)/μl，CD8+T細(xì)胞百分比0.15～0.44，CD4+T/CD8+T 0.71～2.78，NK細(xì)胞計(jì)數(shù)150～1100個(gè)/μl，NK細(xì)胞百分比0.07～0.14，NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)40～300個(gè)/μl，NKT細(xì)胞百分比0.02～0.13，B細(xì)胞計(jì)數(shù)90～560個(gè)/μl，B細(xì)胞百分比0.05～0.18)。

6. 淋巴細(xì)胞檢測(cè)：采用法國ABX公司ABX PENTRA DF 120全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比[正常參考值：淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(0.8～4)×109/L，淋巴細(xì)胞百分比20%～40%]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究計(jì)量資料呈偏態(tài)分布，以M(Q1，Q3)表示，采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；計(jì)數(shù)資料采用“例數(shù)”和“構(gòu)成比(%)”表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以IGRA檢測(cè)結(jié)果(陽性和假陰性)為因變量，采用多因素logistic回歸分析與IGRA檢測(cè)出現(xiàn)假陰性有關(guān)的因素，采用逐步法進(jìn)行變量篩選。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者血清生化指標(biāo)的比較

兩組患者CA125、ESR、CRP、淋巴細(xì)胞百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IGRA假陰性組淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯少于IGRA陽性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各血清生化指標(biāo)水平在兩組患者中的比較[M(Q1，Q3)]

二、兩組患者T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

IGRA假陰性組患者T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于IGRA陽性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各T細(xì)胞亞群水平在兩組患者中的比較[M(Q1，Q3)]

三、多因素分析

將IGRA假陰性組和IGRA陽性組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)，包括淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)納入進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，以正常值為參照進(jìn)行變量賦值(表4)。結(jié)果顯示，NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)低于正常值(<40個(gè)/μl)的患者，IGRA檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的風(fēng)險(xiǎn)是NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)正常者的2.440倍。見表5。

表4 變量賦值表

表5 結(jié)核病患者IGRA檢測(cè)假陰性影響因素的logistic多因素回歸分析

討 論

IGRA是通過結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血淋巴細(xì)胞，然后檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ，用以判定是否存在結(jié)核分枝桿菌感染[1, 5]。目前主要有兩種IGRA檢測(cè)方法：(1)應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)全血樣本被結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的水平。(2)運(yùn)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)檢測(cè)被結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后能夠釋放IFN-γ的T細(xì)胞計(jì)數(shù)。當(dāng)外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)少于0.5×109/L時(shí)，ELISPOT 敏感度明顯高于ELISA[2]，本研究外周血淋巴細(xì)胞均大于0.5×109/L，故采用第一種檢測(cè)方法。IGRA對(duì)于結(jié)核感染檢測(cè)的敏感度為81.7%～97.1%，特異度為75.2%～95.6%[2]，明顯高于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、結(jié)核抗體檢測(cè)，以及病原學(xué)、分子生物學(xué)和病理檢測(cè)效率，且不受既往卡介苗及糖皮質(zhì)激素治療的影響，但仍存在一定比例的假陰性。

研究者對(duì)IGRA假陰性的影響因素結(jié)論不完全一致。Yamasue等[6]提出，高齡和低外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)可能是IGRA假陰性結(jié)果的常見危險(xiǎn)因素。Nguyen等[7]提出，高齡、HIV感染、非西班牙裔白種人與IGRA陰性結(jié)果相關(guān)，且IGRA結(jié)果為陰性的結(jié)核病患者死亡率較高，推測(cè)原因是治療延遲。錢宏波等[2]通過對(duì)387例艾滋病患者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)艾滋病患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≤50個(gè)/μl 時(shí)IGRA陽性率明顯下降。同樣全文和陸興[8]提出，在艾滋病并發(fā)結(jié)核病患者中，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)TB-IGRA的陽性率有明顯影響，對(duì)于CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較低的患者，尤其是≤50個(gè)/μl的患者，IGRA的敏感度明顯降低。Pai等[9]提出，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞明顯低于正常范圍的患者容易出現(xiàn)IGRA的假陰性結(jié)果。但是童鳳軍等[10]提出IFN-γ在HIV與MTB雙重感染者中有較高表達(dá)，IFN-γ水平在抗結(jié)核治療過程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是其與CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)未見相關(guān)性。Kim 等[11]提出，肺外結(jié)核的IGRA假陰性率可達(dá)28.8%，尤其是胸膜及骨結(jié)核。Di和Li[12]亦提出肺外結(jié)核(如胸膜、骨結(jié)核及中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核)的假陰性比例明顯高于肺結(jié)核。Santos等[13]提出，年齡超過70歲和酗酒是肺結(jié)核IGRA陰性的影響因素，而肺外結(jié)核IGRA不受影響。丁興龍等[14]提出IGRA對(duì)矽肺并發(fā)肺結(jié)核及肺外結(jié)核的診斷敏感度一致。鐘華清等[15]通過對(duì)2200例非結(jié)核病患兒及34例活動(dòng)性結(jié)核病患兒進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)IGRA檢測(cè)結(jié)果與性別、年齡、卡介苗接種史、結(jié)核病接觸史、機(jī)體免疫狀態(tài)和感染部位無關(guān)。巫麗蘭和譚守勇[16]提出IGRA檢測(cè)結(jié)果不受低蛋白血癥影響。徐瑤等[17]認(rèn)為，初治抗結(jié)核治療2個(gè)月后IGRA的陽性率可能逐漸下降，但仍無法鑒別結(jié)核分枝桿菌潛伏感染及活動(dòng)分期。綜上所述，IGRA的檢測(cè)結(jié)果受到多種因素的影響，如何分析和應(yīng)用這個(gè)檢測(cè)結(jié)果是臨床診斷治療過程的一個(gè)熱點(diǎn)問題。

本研究已經(jīng)排除已知的年齡過大、免疫抑制和腫瘤等影響因素，發(fā)現(xiàn)IGRA假陰性組和陽性組在性別、年齡、結(jié)核病灶部位、初復(fù)治、耐藥情況、采血前抗結(jié)核治療時(shí)間、糖尿病病史、吸煙史方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且兩組患者ESR、CRP、CA125、淋巴細(xì)胞百分比等化驗(yàn)指標(biāo)差異亦均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

人體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫防御反應(yīng)分為先天性免疫和適應(yīng)性免疫。NK細(xì)胞是先天性免疫的主要參與者，T淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫的代表[18]。T細(xì)胞主要由CD4+和CD8+T細(xì)胞組成?！督Y(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)及臨床應(yīng)用專家共識(shí)》[19]表明，結(jié)核病患者大部分會(huì)出現(xiàn)CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，因此其百分比相應(yīng)降低，CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)亦出現(xiàn)不同程度的降低，但其程度輕于CD4+T細(xì)胞，因此其細(xì)胞比例可能相對(duì)升高，導(dǎo)致CD4+/CD8+不變或降低。T淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例較高，其比例變化會(huì)引起其他細(xì)胞比例出現(xiàn)變化。重癥結(jié)核病患者T淋巴細(xì)胞總體降低，但比例可能無明顯變化。CD4+T細(xì)胞是產(chǎn)生IFN-γ的主要細(xì)胞，而CD8+T細(xì)胞亦能產(chǎn)生一定的IFN-γ。因此T細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，IGRA的假陰性率可能會(huì)提高。

NKT是數(shù)量較少的一類細(xì)胞，發(fā)育成熟的細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞的TCRαβ和NK細(xì)胞的NKR-P1受體[20]，具有T細(xì)胞和NK細(xì)胞兩重性質(zhì)。活化的NKT細(xì)胞快速大量產(chǎn)生細(xì)胞因子，包括IFN-γ、IL-4 等，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫。同時(shí)，NKT可釋放穿孔素、Fas 配體等溶解靶細(xì)胞，從而起到抗結(jié)核分枝桿菌的作用[21]。NKT細(xì)胞是聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫的橋梁之一，對(duì)IFN-γ的釋放亦有較明顯的作用，可能影響IGRA的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，IGRA假陰性組外周血淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于陽性組，還發(fā)現(xiàn)這些結(jié)果低于正常值低限。logistic多因素分析結(jié)果顯示，NKT細(xì)胞減少是IGRA假陰性的危險(xiǎn)因素。NKT細(xì)胞數(shù)越高，IGRA陽性可能性越大，NKT細(xì)胞數(shù)越低，IGRA假陰性可能性越大。這提示在臨床實(shí)踐中T細(xì)胞亞群檢測(cè)，尤其是NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)有助于解釋IGRA結(jié)果。

本研究為回顧性分析，病例信息完整的患者數(shù)量有限，因此納入分析的患者例數(shù)較少，研究僅能反映出一種趨勢(shì)，供臨床工作者參考。此外，本研究回歸模型契合度較差，其診斷臨界值有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析。