肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的檢測及基因型分析

董大光，王 健，潘亞萍，沈繼錄，徐元宏

肺炎克雷伯菌是臨床分離及醫(yī)院感染的重要致病菌之一，隨著β-內酰胺類及氨基糖苷類等廣譜抗菌素的廣泛使用，細菌易產生超廣譜β-內酰胺酶和頭孢菌素酶以及氨基糖苷類修飾酶，尤為嚴重的是對碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的持續(xù)增加[1-2]，給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。該文收集了25株CRKP，對耐藥性、耐藥基因進行檢測以及流行狀況進行了初步分析，以探究CRKP的耐藥機制及其流行情況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 收集2016年1月～12月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院分離的25株對碳青霉烯類具有很強耐藥性的肺炎克雷伯菌，將之作為本次研究的對象，并且做到同一個患者沒有重復分離株。采用質控標準菌株大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2儀器 全自動的Vitek 2 Compact微生物系統(tǒng)和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜均購自法國生物梅里埃公司；GeneAmp970基因擴增儀購自美國PE公司。

1.1.3試劑 血平板、麥康凱平板、MH平板等培養(yǎng)基購自合肥天達診斷試劑有限公司；藥敏紙片購自英國OXOID公司；亞胺培南粉末購自國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司；細菌蛋白抽提液購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.4引物 標志物DL2000、Ex Taq DNA聚合酶試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖、引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物序列：F：5′-TCTGGACCGCTGGGAGCTGG-3′；R：5′-TGCCCGTTGACGCCCAATCC-3′。片段大小為510 bp。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定和藥敏實驗 細菌鑒定和藥敏試驗采用VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)，部分藥物補充K-B法，具體標準參照CLIS 2016推薦的方法。

1.2.2產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌表型篩選

1.2.2.1改良Hodge試驗(modified Hodge test，MHT) 把0.5麥氏濁度的大腸桿菌ATCC 25922的懸浮液1 ∶10稀釋后均勻涂布于藥敏試驗平板上。于平板正中央貼10 μg/片美羅培南藥敏紙片，將待測菌挑取出來，自紙片外緣向平板邊緣劃線接種待檢菌，經(jīng)35 ℃培養(yǎng)過夜后判定效果。

1.2.2.2Carba NP(Carbapenemase Nordmann-Poirel)試驗 制備A液(含0.1 mmol/L硫酸鋅的酚紅溶液)和B液(A液中加入6 mg/ml 亞胺培南)。分別標記1.5 ml離心管為a、b，每管中加入100 μl 細菌蛋白抽提液，從37 ℃培養(yǎng)24 h血平板上挑取受試菌株，振蕩混勻5 s，a管中加入100 μl A液，b管中加入100 μl B液，渦旋振蕩混勻，置于37 ℃孵箱，每0.5 h觀察記錄顏色變化至孵育2 h結束。

1.2.2.3改良碳青霉烯滅活試驗(modified Carbapenem inactivation method，mCIM) 取1 μl接種環(huán)的過夜培養(yǎng)純菌落于2 ml TSB肉湯中，震蕩混勻，每管菌懸液放入一張含10 μg美羅培南的無菌紙片，(35±2) ℃孵育4 h后，用0.5麥氏濁度的大腸埃希ATCC 25922菌懸液(直接菌懸法)涂布平板，干燥3～10 min，將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC25922的MH平板上。倒置平板，孵育18～24 h后量取抑菌圈直徑。

1.3金屬酶表型EDTA協(xié)同試驗準備MH藥敏瓊脂平皿和待測菌，將過夜待測菌用無菌生理鹽水調至0.5麥氏濁度的菌懸液，將菌液均勻涂布于MH平皿上，靜置10 min待干燥，將10 μg/片亞胺培南貼在MH平皿上，距其1 cm處貼一張EDTA(吸附有0.5 mol/L EDTA 10 μl)紙片。35 ℃培養(yǎng)18 ～24 h后觀察結果。

1.4產肺炎克雷伯菌型碳青霉烯酶基因檢測采用煮沸裂解法提取總DNA為模板。blaKPC基因擴增，擴增條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，如此循環(huán)33次；最后在72 ℃下延伸5 min。對PCR產物進行電泳分析。上海生工公司對擴增產物進行測序，對測序結果進行比對。

1.5耐藥菌株同源性分析煮沸法制備細菌DNA，ERIC-PCR的引物序列ERIC1：ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC；ERIC2：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。擴增條件是：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，如此循環(huán)20次，接著94 ℃變性1 min, 42 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，如此循環(huán)35次，最后在72 ℃延伸5 min。取出擴增產物10 μl，加入到1.5%瓊脂糖凝膠里，開始電泳分析。判定標準為主要的條帶位置和數(shù)量相同為同一基因型。

1.6統(tǒng)計學處理使用WHONET 5.6軟件對K-B法的藥敏結果和儀器法最小抑制濃度(MIC)藥敏結果進行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結果

2.1藥物敏感實驗結果所分離的25株肺炎克雷伯菌中，復方新諾明和米諾環(huán)素的耐藥率較低，分別為28%和4%。其他抗生素(頭孢菌素、喹諾酮類、青霉素類、青霉素/青霉素酶抑制劑、氨曲南等)均高度耐藥。見表1。

表1 25株耐碳氫酶類菌對18種抗菌藥物的耐藥率

2.2MHT試驗、CarbaNP試驗和mCIM試驗結果對25株肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型檢測，3種試驗結果相同，24株CRKP陽性，陽性率為96%，陰性株為同一標本。見圖1～3。

2.3EDTA協(xié)同試驗亞胺培南-EDTA協(xié)同試驗檢測25株耐藥菌株的金屬酶表型，沒有發(fā)現(xiàn)陽性菌株。見圖4。

圖1 改良Hodge試驗碳青霉烯酶檢測結果

1：陽性質控菌ATCC BAA1705；2：陰性質控菌株ATCC BAA1796；3、4：受試菌株，陽性結果

圖2 Carba NP試驗碳青霉烯酶檢測結果

圖3 改良碳青霉烯滅活試驗碳青霉烯酶檢測結果

圖4 EDTA協(xié)同試驗檢測結果

2.4KPC酶基因檢測結果24株碳青霉烯酶表型試驗陽性的CRKP進行PCR擴增，DNA產物進行測序對比，結果顯示均為KPC-2型基因，1株碳青霉烯酶表型檢測的陰性株KPC酶基因檢測結果為陰性。見圖5。

2.5ERIC-PCR基因分型25株CRKP主要分為8型，其中Ⅰ型3株，Ⅱ型最多共14株，Ⅲ型和Ⅶ型各2株，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型各1株。見圖6。

圖5 部分臨床菌株KPC基因電泳圖

M：Marker；8號株的KPC基因陰性，其他菌株均為陽性

圖6 部分臨床菌株ERIC-PCR基因分型圖譜

M：Marker；1、2、9為Ⅰ型；3、4、5、8、12、13、15、17為Ⅱ型；6、7為Ⅲ型；10為Ⅳ型；11為Ⅴ型；14為Ⅵ型；16為Ⅶ型

3 討論

肺炎克雷伯菌在臨床和醫(yī)院感染中是重要的致病菌，對外界有強烈的抵抗力。我院25株CRKP藥敏結果顯示，復方新諾明的敏感率為72%，對米諾環(huán)素的敏感率為92%，其他抗菌藥物均高度耐藥。提示CRKP常常伴隨對其他抗生素也耐藥，形成多重耐藥，給臨床抗感染治療帶來極大困難，而臨床治療CRKP感染可以選用四環(huán)素類抗生素和復方新諾明。

CLSI在2009年推薦了MHT試驗，該實驗用于檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的表型，是一種常規(guī)的方法。2015年時，CLSI引進了Carba NP試驗，該實驗除可用于檢測腸桿菌科，還可以檢測銅綠假單胞菌和不動桿菌屬碳青霉烯酶的表型[3]。mCIM是由Van et al[4]發(fā)現(xiàn)的快速檢測碳青霉烯酶的實驗，并于2017年CLSI新指南推薦采用mCIM檢測碳青霉烯酶。它們共同優(yōu)點在于使用簡便，并且成本很低，檢測具有很高的準確率，因此，適合臨床微生物室開展，被廣泛用于檢測產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌。唐海玲 等[5]通過與PCR法比較，用Carba NP試驗方法，篩查多重耐藥革蘭陰性桿菌產碳青霉烯酶，具有97.06%的敏感性和100%特異性，效果很好。同時文獻[6]也表明Carba NP試驗在檢測KPC、NDM、VIM、IMP、SPM和SME型碳青霉烯酶方面具有較好的敏感性(>90%)和特異性(>90%)。Tijet et al[7]用mCIM與Carba NP兩種方法檢測182株腸桿菌科細菌，兩者均可有效地檢測出碳青霉烯酶。余佳佳 等[8]用mCIM，以154株臨床分離的腸桿菌科細菌為對象，篩查出了產碳青霉烯酶的細菌，將其與MHT結果進行比較發(fā)現(xiàn)，mCIM具有符合率和特異性高、結果易于觀察等優(yōu)勢。該實驗25株CRKP分別進行Hodge、Carba NP和 mCIM試驗，結果發(fā)現(xiàn)三組試驗結果相同，有24株陽性，占總數(shù)的96%，非常接近儲雯雯 等[9]報道的陽性率93.2%。碳青霉烯酶篩選試驗陽性的24株CRKP進行PCR擴增和電泳分析，共出現(xiàn)23個目標帶，PCR擴增產物測序結果都是KPC-2型耐藥基因，1株PCR陰性的菌株耐藥機制有待于進一步深入研究。

MHT試驗不足之處是其特異度表現(xiàn)上不夠，尤其在弱陽性菌株檢測時，很難分析Hodge試驗的結果。Carba NP試驗可以快速檢測碳青霉烯酶的表型，但需要特殊的試劑以及無法檢測某些碳青霉烯酶(如染色體編碼的OXA型碳青霉烯酶)，在檢測OXA-232型碳青霉烯酶存在一定的假陰性。且目前CLSI只有腸桿菌科細菌標準的mCIM。同種細菌在金屬酶的特異性作用下可能會出現(xiàn)不同的金屬酶基因，檢測相應的基因就需要設計不同的引物，且只能檢測已知耐藥基因，因此耗時長。因此我們主要采用EDTA作為酶抑制劑，結果發(fā)現(xiàn)金屬酶檢測試驗結果均為陰性，可能產其他型酶，有待檢測。

25株CRKP主要來自ICU和血液內科，且標本類型主要為血液標本。通過ERIC-PCR分型，25株肺炎克雷伯菌可分為8個亞型：Ⅰ型3株，Ⅱ型14株，Ⅲ型和Ⅶ型各2株，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型各1株。該8個型別分布于多個科室，未呈現(xiàn)出集中于某個科室。

綜上所述，MHT試驗、Carba NP試驗和mCIM試驗，對于碳青霉烯酶的篩查均快捷、簡單、易行。此外，我院產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的基因型主要為KPC-2，其耐藥形式嚴重，而四環(huán)素類藥物對其有良好的體外抗菌活性。因此臨床要加強防范，合理應用抗生素治療該菌的感染及監(jiān)控耐藥株的傳播。