楓香葉采后揮發(fā)物表征及影響因子研究

高艷芳，薛彬娥，郭 微，吳 偉，勞清華，吳莉嫻，李永泉，張 暉

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣東 廣州 510225)

植物揮發(fā)性有機化合物(PVOCs)是植物在生長發(fā)育過程中通過各種次生代謝途徑合成和釋放的低沸點、易揮發(fā)的小分子有機化合物的總稱，包括烴類、醇類、醛類、酮類、有機酸類、內(nèi)酯類、含氮化合物和有機硫類[1—2]。植物器官和組織在自然狀態(tài)下會分泌和釋放具有芳香氣味的有機揮發(fā)性物質(zhì)，這被認為是大自然長期進化選擇的結(jié)果，是對環(huán)境的適應或繁衍需要[3]。這些物質(zhì)通常具有抗菌、殺菌、凈化空氣、消除疲勞等功能[4—5]。

楓香(Liquidambar formosana)系金縷梅科(Hamamelidaceae)楓香樹屬(Liquidambar)落葉植物，最新分類系統(tǒng)將其置于蕈樹科(Altingiaceae)[6]。楓香種源遍及秦嶺以南溫暖濕潤的地區(qū)[7]，適宜性強[8]，景觀優(yōu)美，具良好滯塵抑菌作用，被廣泛應用于園林綠化中[9]。同時，楓香全株可入藥，在民間應用廣泛[10]。楓香葉內(nèi)含具抑菌[11—12]、水果保鮮[13—14]、抗炎[15]、抗氧化[14]、防腐[16]等作用的化合物，可進一步開發(fā)其食品保鮮、醫(yī)藥、化妝品市場。目前，對于楓香葉揮發(fā)性組分的研究主要集中于提取與加工工藝。對楓香采后存放過程中揮發(fā)性化合物組分變化的研究尚未見報道。為此，本研究擬采用氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用技術(shù)，探究楓香葉片揮發(fā)性組分在不同發(fā)育程度、干燥時間、儲存方式及萃取溫度下的消長規(guī)律，為楓香葉采后處理及高值化資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

楓香葉取自仲愷農(nóng)業(yè)工程學院白云校區(qū)，植株樹勢中等，正常掛果，于樹冠外圍中部各方位選取大小均勻、葉色一致、無傷病葉片。將葉片按照不同成熟程度分類采集，按不同方式儲存?zhèn)溆?表1)。

表1 楓香葉采后貯藏及萃取條件Table 1 Post-harvest storage and extraction conditions of Liquidambar formosana leaves

1.2 儀器與設備

儀器：Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)、TVOC采樣管/Tenax-TA吸附管(6 mm × 150 mm)玻璃材質(zhì)(安徽中析儀器設備有限公司)、數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 樣品萃取與測定

1.3.1 萃取方法

稱取5 g樣品，剪碎置于250 mL錐形瓶內(nèi)，恒溫水浴加熱1 h，利用針筒進行間歇抽氣，抽氣頻率為10 min抽取3次，以提高吸附效率，將樣品有機揮發(fā)物(VOCs)充分富集于Tenax-TA吸附管中，然后經(jīng)2 mL正己烷慢速洗脫，洗脫液過0.22 μm濾膜以備用。每個處理3次重復。

1.3.2 儀器條件

儀器采用Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為HP-INNOWAX毛細管柱(30 m ×250 μm，0.25 μm)，進樣口溫度 160 ℃，升溫程序：初始溫度 50 ℃，保持 1 min，5 ℃·min-1上升至100 ℃，保持 5 min，再以 8 ℃·min-1上升至 230 ℃，保留25 min。

質(zhì)譜條件：離子化方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度280 ℃，四級桿溫度150 ℃，全掃描模式，質(zhì)量范圍 33～350 amu(m/z)，載氣為氦氣，流速 1 mL·min-1。

1.4 質(zhì)譜圖分析

由 GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在美國國家標準與科學技術(shù)研究院(NIST08)質(zhì)譜庫中進行檢索，結(jié)合相關(guān)文獻和人工譜圖解析對各個化合物進行定性，同時用面積歸一化法計算各成分相對含量，確認楓香葉芳香化學組分及處理間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育程度的楓香葉揮發(fā)性組分差異

楓香嫩葉和成熟葉的揮發(fā)物組分數(shù)量無顯著差異。其中，嫩葉中檢測到15種萜烯類化合物，以β-水芹烯、α-蒎烯、β-側(cè)柏烯為主；成熟葉中檢測到 13種萜烯類化合物，以 β-側(cè)柏烯、松油烯、4-蒈烯為主(表2)。部分物質(zhì)僅存在于嫩葉中，如莰烯、β-萜品烯、羅勒烯等；3-蒈烯及 γ-松油烯僅存在于成熟葉中；嫩葉的 α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯相對含量均高于成熟葉，而成熟葉中檜烯、β-側(cè)柏烯、月桂烯、蒈烯、γ-松油烯等化合物相對含量高于嫩葉。

表2 不同發(fā)育程度楓香葉萜烯類組分及相對含量Table 2 Components and relative contents of terpenes in Liquidambar formosana leaves at different developmental levels

2.2 不同干燥時間對楓香揮發(fā)性組分的影響

干燥時間對楓香葉揮發(fā)性化合物的影響見表3、圖1。α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、β-水芹烯、檸檬烯等主要揮發(fā)性成分相對穩(wěn)定，在不同干燥時間的楓香葉中均被檢測到。不同干燥時間分別檢測出14(0 d、鮮葉)、11(1 d)、10(2 d)、10(3 d)、10(4 d)、9(5 d)、14(6 d)種揮發(fā)性成分(圖1)。0 d 與 1 d、2 d、3 d、4 d、5 d樣品所檢測得到的化合物數(shù)量呈現(xiàn)出顯著差異。第0、6 d均檢測到14種化合物(圖1)，但0 d所檢測到的萜烯類化合物種類較6 d多(表3)。干燥6 d檢測到的萜烯類化合物最少，僅 5種。β-萜品烯、松油烯僅在鮮葉(干燥1 d)中被檢測到。

圖1 不同干燥時間下楓香葉揮發(fā)性化合物數(shù)量的變化Fig. 1 Number of volatile compounds in Liquidambar formosana leaves at different drying time

圖2 不同儲存方式下楓香葉揮發(fā)性化合物的數(shù)量Fig. 2 Number of volatile compounds in Liquidambar formosana leaves under different storage conditions

表3 不同干燥時間下楓香葉萜烯類組分及其相對含量Table 3 Components and relative contents of terpenes in Liquidambar formosana leaves at different drying times

2.3 不同儲存方式對楓香揮發(fā)性組分的影響

以不同儲存方式下干燥8 d(恒重)的楓香葉樣品為材料，萃取溫度70 ℃，對其揮發(fā)性成分進行檢測。如圖2所示，-5 ℃為最佳儲存方式，可保留更多揮發(fā)性化合物，共計13種，顯著高于17 ℃干燥和25℃干燥條件下保留的揮發(fā)性化合物，即-5 ℃保存下?lián)]發(fā)性有機化合物更為穩(wěn)定。表4顯示，側(cè)柏烯、月桂烯僅在冷凍干燥儲存下檢測到，萜品油烯僅在17 ℃干燥儲存方式下檢測得到。α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、檸檬烯、β-側(cè)柏烯等主要化合物表現(xiàn)較為穩(wěn)定，在不同儲存方式下均被檢測到。17 ℃干燥儲存的楓香葉最多可檢測到10種揮發(fā)物，且在此儲存方式下 α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、檸檬烯的相對含量較-5 ℃及25 ℃干燥儲存的高。

表4 不同儲存方式下楓香葉萜烯類組分及相對含量Table 4 Components and relative contents of terpenes in Liquidambar formosana leaves under different storage methods

2.4 不同萃取溫度對楓香揮發(fā)性組分的影響

比較不同萃取溫度條件下楓香葉揮發(fā)性組分的差異(圖3)。在90 ℃下可萃取得到9種揮發(fā)性化合物，顯著高于 50 ℃、25 ℃。70 ℃最多可萃取得到8種揮發(fā)性組分。25 ℃萃取效果最差，最多可得到4種揮發(fā)物。由表5可以看出，萜烯類化合物中的 β-側(cè)柏烯僅在 90 ℃萃取條件下檢測到，室溫萃取后僅檢測到1種萜烯類化合物(α-蒎烯)。70 ℃萃取得到的萜烯類化合物相對含量均較90 ℃高，α-蒎烯、檸檬烯相對含量較50 ℃萃取的低。在控制成本的情況下，選擇70 ℃作為揮發(fā)物萃取溫度，可得到更多的萜烯類化合物。

圖3 不同萃取溫度下楓香葉揮發(fā)性化合物數(shù)量Fig. 3 Number of volatile compounds in Liquidambar formosana leaves at different extraction temperatures

表5 不同萃取溫度下楓香葉萜烯類組分及相對含量Table 5 Components and relative contents of terpenes in Liquidambar formosana leaves at different extraction temperatures

3 討論

植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累受其生長發(fā)育的影響[17]。楓香成熟葉與嫩葉揮發(fā)性化合物數(shù)量無顯著差異，但嫩葉較成熟葉含更多揮發(fā)性組分，所檢測到的主要揮發(fā)性成分 α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯相對含量也較高。分析結(jié)果還表明，3-蒈烯、γ-松油烯僅存在于成熟葉中，而莰烯、β-萜品烯、羅勒烯僅存在于嫩葉中。Southwell等[18]指出，部分單萜和倍半萜的生物遺傳途徑在第一片子葉出現(xiàn)時就開始作用，如蒎烯。但并非所有的化合物的合成途徑均從發(fā)育早期就已經(jīng)開始，松油烯就是在個體發(fā)育后期才開始形成。不同發(fā)育程度葉片化合物的種類與含量存在差異，這可能與不同化學成分合成途徑及其生物功能差異有關(guān)。

干燥是植物組織或器官長期保存的最好方法之一[19]。本研究中，α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、檸檬烯等主要揮發(fā)性成分表現(xiàn)相對穩(wěn)定，在不同干燥時間內(nèi)均被檢測到。Raina等[20]研究指出，長期貯藏對藏紅花風味濃度有較大影響。龍玲等[21]也認為，隨著干燥時間延長，尾葉桉木材總揮發(fā)性有機物釋放速率逐漸降低。干燥時間延長使得揮發(fā)性組分減少或消失，同時又有部分揮發(fā)物合成，如酯類物質(zhì)和酚類物質(zhì)。干燥時間對于楓香揮發(fā)性成分影響較小，可能與本研究涉及的干燥時間閾值較小有關(guān)。

Raina等[20]提出不同干燥條件對物種化合物含量有重要影響。楓香葉冷凍干燥儲存和17 ℃儲存可保留更多化合物，室溫保存會失去較多化合物，但 α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、β-側(cè)柏烯、檸檬烯等主要揮發(fā)性成分仍可被檢測到。沈靜等[22]認為干燥方式對香氣的影響最大，Song等[23]也得出同樣的結(jié)論。

萃取溫度不同也導致所測的植物揮發(fā)性化合物有所差異[24—25]。楓香葉高溫萃取可獲得更多的揮發(fā)性化合物，在90 ℃時可檢測到9種揮發(fā)性成分。室溫萃取所得化合物種數(shù)雖最少，但更能反映園林應用中楓香葉芳香物質(zhì)揮發(fā)的實際情況。

芳香物質(zhì)的開發(fā)利用是楓香資源開發(fā)利用的重要方面，楓香葉、樹脂均可提制 α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯、檸檬烯等多種揮發(fā)性化合物[26—27]，這些化合物是醫(yī)藥、化工、香料工業(yè)的重要原料。楓香釋放的揮發(fā)性有機化合物包含烯類、醇類、酯類、醛類、酮類及烷烴類等 6大類揮發(fā)性有機化合物，其中以萜烯類化合物為主要芳香化合物[2]，構(gòu)成了楓香的獨特香氣。這類次生代謝產(chǎn)物在提高植物保護能力、生存競爭能力以及協(xié)調(diào)植物與環(huán)境的關(guān)系方面發(fā)揮重要作用，其合成及分解與生長階段、環(huán)境條件和氣候因素有著較強的相關(guān)性和對應性[28]。由于植物揮發(fā)性有機化合物的合成與釋放機制較為復雜，且楓香為彩色落葉植物，次生代謝過程更加復雜，故其影響機制需更細致的研究。

致 謝：仲愷農(nóng)業(yè)工程學院園藝園林學院梁晴，化學化工學院張漢輝、東方云等人為采樣與提取測定給予大力支持，謹致謝意。