鳳丹牡丹花朵不同發(fā)育時期揮發(fā)性成分積累規(guī)律與蒸餾工藝研究

孔 凡，郝 青，劉政安，舒慶艷*

(1. 中國科學院植物研究所中科院北方資源植物重點實驗室，北京 100093；2. 中國科學院大學，北京100049；3. 青島農業(yè)大學園林與林學院，山東 青島 266109)

牡丹(Paeonia suffruticosa)是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)多年生落葉亞灌木，原產于中國，在我國有1600余年栽培史。牡丹也是重要的資源植物，兼具觀賞、藥用和食用價值。2011年鳳丹(P. ostii)和紫斑牡丹(P. rockii)籽油獲批新資源食品，2013年鳳丹花瓣獲批新資源食品原料。此外，牡丹花水、牡丹提取物等已被批準列入化妝品原料目錄(2021版)，擴大了其應用范圍。目前以牡丹花為材料的相關研究主要集中于色素組成、含量、呈色機理及花瓣提取物的抗氧化活性等，分離鑒定的化合物主要有黃酮、黃酮醇及花色苷類，還含有脂肪酸、多糖、蛋白質、微量元素、維生素及香氣物質等多種成分[1—4]。此外，對牡丹花瓣中重要成分的提純工藝研究也有報道。王曉等[5—6]利用超聲提取和酶解法建立牡丹花總黃酮的最佳提取工藝；劉建華等[7]利用GC-MS研究牡丹開放時期鮮花中的揮發(fā)性成分，通過對菏澤多個牡丹品種的花混合蒸餾，共鑒定出 49 種化合物。周海梅等[8]應用頂空固相微萃取技術對洛陽 10個牡丹品種花瓣提取并鑒定出34種揮發(fā)性成分。Li等[1]利用頂空固相微萃取法結合 GC-MS技術從 30個牡丹品種花瓣中共檢出168 種揮發(fā)性成分，其中多數是萜烯類、醇類和烷烴類，也含有少量酮類、醛類、酸類和其他化合物。李雙[9]以菏澤牡丹花為原料建立牡丹精油最佳提取工藝為蒸餾時間4 h、液料比15 mL·g–1、氯化鈉濃度5%；還建立了超高壓提取牡丹花精油最佳工藝條件，提取率達 0.7265%。張志超等[10]比較了溫浸提取、回流提取、超聲提取鳳丹牡丹中的花青素工藝，確定超聲提取花青素效率最高，工藝穩(wěn)定。周暢等[11]利用有機溶劑萃取白牡丹干花成分，共檢出78種化合物，其中烷烴類化合物占比最大達51.30%。吳曉瑩[3]發(fā)現(xiàn)牡丹花瓣中的脂肪酸主要包括硬脂酸、十六烷酸和亞油酸，含有微量的α-亞麻酸。上述研究均為盛開時的牡丹花，對不同發(fā)育時期花瓣中揮發(fā)性成分合成與積累規(guī)律的研究尚未見報道。

此外，關于牡丹花朵發(fā)育進程中小分子揮發(fā)物的積累規(guī)律及未開放的花朵蒸餾工藝研究較為匱乏。尤其是近年來，由于牡丹花蕊茶的熱銷，引起研究者對未開放花朵揮發(fā)性成分的關注。未開放花苞是摘取花蕊的最佳原料，隨之而來的是花瓣在摘取之后變成了廢棄物，造成較大資源浪費，因此將其進行蒸餾獲得牡丹花露，用于護膚及食品領域可充分發(fā)揮其價值。到目前為止，對牡丹花瓣蒸餾獲得揮發(fā)性成分的含量均為相對含量(峰面積法，數值是94.78%)[12]，對絕對含量了解甚少，不利于作為原料進行精確添加。因此，本研究以鳳丹不同發(fā)育時期的花為材料，通過設置料液比及蒸餾時間進行正交實驗設計，研究其花瓣揮發(fā)性成分積累規(guī)律與蒸餾工藝，為其開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

利用鳳丹牡丹大風鈴期(S1)、圓桃期(S2)和破綻期(S3)三個發(fā)育時期的花瓣為原料[13]，對應花瓣顏色分別為綠色、淺黃色及白色，均為花朵開放(盛花期)之前采樣，去掉花蕊，清洗干凈，用于后續(xù)蒸餾。

1.2 含水率測定

稱取不同時期的花瓣鮮重，烘干至恒重后稱重，計算含水率。

1.3 水蒸氣蒸餾

利用三因素三水平正交試驗設計 9個處理(表1)，其中三因素三水平分別是發(fā)育時期(S1～S3)、料液比(花瓣鮮重與純凈水重量比設為1:1、1:2和1:3)、蒸餾時間(1 h、2 h和3 h)。蒸餾設備購自成都普檢儀器有限責任公司(TX05-02G)，先用電磁爐(1000 W)加熱至有水蒸氣出現(xiàn)后調至800 W進行蒸餾，蒸餾壓力為常壓，蒸餾溫度 100℃，收集蒸餾后冷凝的澄清透明液體，即牡丹花露，用于后續(xù)分析。

表1 用于牡丹花水加工工藝正交試驗設計Table 1 Orthogonal experimental design of peony flower extraction processing technology

1.4 GC-MS檢測方法

固相微萃取采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭，購自美國Sigma公司(Lot: 139108)。試驗前萃取纖維頭在氣相色譜進樣口于 250 ℃老化兩次，每次0.5 h，清洗2次。色譜條件：HP-5MS(30 m × 250 μm × 0.25 μm)彈性石英毛細管柱；載氣He，不分流(樣品 1、5、9、11、15和16)或者2V1分流(樣品 21、22和 26)，恒流 1.0 mL·min–1；進樣口溫度250 ℃；柱溫：初溫40 ℃，恒溫2 min，以 2 ℃·min–1速率升溫至 152 ℃，保持 2 min，然后以 20 ℃·min–1升溫至 310 ℃，保持 0 min，運行310 ℃，2 min。質譜條件：EI離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，電子能量為70 eV，掃描范圍為30～500 amu。取5 mL 牡丹花露置于20 mL棕色螺口玻璃頂空瓶中，用50/30 μm萃取纖維頭于瓶內萃取30 min后取出，在 GC-MS進樣口 250 ℃解析 3 min，進行GC-MS(HP7890 B/7000 C型，美國安捷倫科技公司)測定。

定性標品為正構烷烴C7-C40，定量標品為二辛醇(濃度 0.0072 mg·mL–1)。通過在相同條件下加入的C7-C0保留時間計算保留指數(RI)。

利用 Agilent G1701DA MSD Productivity ChemStation軟件對GC-MS檢測結果進行分析，對采集到的質譜圖用NIST05.L和RTLpest.L譜庫進行分析，對照標品峰面積，采用>0.03%進行積峰，并根據標品進行濃度計算，確定牡丹花露中揮發(fā)性成分的濃度及百分含量。

1.5 統(tǒng)計分析與作圖

采用 SPSS軟件單因素方差分析進行差異顯著性分析，采用協(xié)方差矩陣進行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，計算主成分特征值；采用R軟件進行統(tǒng)計分析。采用Excel和TBTools軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)育時期花瓣特征及含水率

對三個發(fā)育時期的鳳丹牡丹花瓣隨機稱取測定鮮重和干重，計算含水率。結果表明，S1期含水率最高、S2期含水率最低，隨著花朵發(fā)育進程，花瓣由綠逐漸變黃到白，含水率S2期先降低S3期再升高(表2)。

表2 不同發(fā)育時期鳳丹花瓣生物量Table 2 The biomass of petals at different developmental stages of Paeonia ostii

2.2 不同發(fā)育時期不同蒸餾工藝的牡丹花水中化合物種類及含量分析

三個不同發(fā)育時期，采用不同蒸餾工藝在 9個樣品中共鑒定出145個揮發(fā)性成分，其中S1期得到 96個化合物(樣品 1為 70個，樣品 5為 54個，樣品9為47個)；S2期檢測到56個化合物(樣品11為53個，樣品15為47個，樣品16為46個)；S3期檢測到48個化合物(樣品21為48個，22和26中均為47個)(表3)。上述揮發(fā)性成分歸為 8大類，分別是醇類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷烴類、酯類和其他類；對各類百分含量進行統(tǒng)計分析，結果如圖1。從總體發(fā)育進程來看，發(fā)育早期(S1，樣品1、5、9)花瓣蒸餾后檢測到化合物占比最大的是其他類化合物，中后期(S2和S3)花瓣蒸餾后化合物占比最大的是烷烴類。從蒸餾工藝來看，不同料液比和蒸餾時間處理，不同種類化合物占比會有所差異。這說明隨著花蕾長大與花瓣伸長，被檢測到的揮發(fā)性成分逐漸減少，但含量逐漸增加。

圖1 鳳丹花瓣不同提取物樣品中8類化合物的百分含量Fig. 1 The percentage of 8 kinds of compounds in different extraction samples of Paeonia ostii petals

表3 鳳丹花瓣不同提取物樣品中化合物數量Table 3 The number of compounds in different extraction samples of Paeonia ostii petals

發(fā)育早期(S1)花瓣采用不同料液比和蒸餾時間提取，發(fā)現(xiàn)共同存在的化合物有24個，在樣品1、5、9中單獨出現(xiàn)的化合物分別有21、10和12個(表3)，基本都在樣品1中含量最高(表4)?？傮w來看，在發(fā)育早期(S1)，蒸餾提取牡丹花瓣中的化學成分，以1:1液料比和蒸餾1 h(樣品1)獲得牡丹花露成分及含量最高。

表4 鳳丹花瓣不同提取物樣品的同類化合物含量比較(mg·L–1)Table 4 Comparison of content of compounds in different extraction samples of Paeonia ostii petals (mg·L–1)

發(fā)育中期(S2)花瓣采用不同料液比和蒸餾時間，發(fā)現(xiàn)共同存在的化合物有40個，在樣品11和15單獨出現(xiàn)的化合物分別有8個和2個，樣品16中沒有單獨出現(xiàn)的化合物(表3)。樣品16中的化合物含量比樣品11和樣品15高(表4)。烷烴類是在三個樣品中占比出現(xiàn)先升高后降低趨勢，樣品15中最高(料液比1:2；蒸餾3 h)；酯類、醇類均比樣品11占比高；萜烯類逐漸增加，在樣品16中達到最高(料液比1:3，蒸餾1 h)(表4)。綜合考慮，S2期以1:3料液比和蒸餾1 h(樣品16)的工藝最佳。

發(fā)育后期(S3)花瓣采用不同料液比和蒸餾時間處理，發(fā)現(xiàn)共有化合物44個。在樣品21中單獨出現(xiàn)的化合物有1個，樣品22和樣品26中均沒有單獨出現(xiàn)的化合物(表3)。樣品21和樣品22中的化合物含量多數比樣品26高，說明料液比和蒸餾時間的處理工藝對化合物種類變化影響不大，但對化合物提取含量有較大影響。S3期花朵揮發(fā)性化合物中不同種類占比與前兩個時期(S1、S2)有較大不同，但含量均比前兩個時期高。占比最高的是烷烴類，在S3期達 41%(樣品 22)；其次是醛類，占比 32%(樣品 22)；此外，其他類占比達 23%(樣品 22)；樣品21、22、26中，醛類、醇類、萜烯類、酮類占比逐漸降低，烷烴類逐漸增加，其他類在樣品22和 26均比21高(表4)。綜合考慮化合物的成分及含量，S3期花朵蒸餾提取以料液比1:2和蒸餾1 h(樣品22)的工藝最佳。

將 9個樣品中各類化合物進行分類及含量加和平均，差異顯著性分析表明，S1和S2期醇類、醛類、酮類、烷烴類、酯類、其他類化合物沒有顯著差異，S3期與前兩個時期差異顯著，且含量均高于 S1和 S2期。從各類化合物提取含量來看，樣品 22最佳，即 S3期花瓣，利用1:2料液比，在蒸餾1 h的提取物所含化合物種類及含量均較優(yōu)(表4)。

2.3 不同工藝主成分分析與聚類分析

將獲得的 9個樣品的揮發(fā)性化合物進行主成分分析，提取出9個主成分，其中前三個主成分累計貢獻率 79.08%，第一主成分貢獻率占39.5%，第二主成分貢獻率占 24.5%；第三主成分貢獻率為15.0%。9個處理在三個主成分中能很好區(qū)分，值得一提的是在 S2和 S3期，各自三個樣品能分別聚合在一起，S1期的三個樣品分散在兩個不同的空間(圖2)，表明早期樣品加工工藝對揮發(fā)性成分影響較大。在獲得主成分基礎上，對不同處理的主要成分的化合物含量進行聚類和熱圖分析(圖3)，結果表明同一發(fā)育時期，不同料液比和蒸餾時間，所獲得化合物聚類在一起，但S1期不同加工工藝對揮發(fā)性成分有一定影響，不同料液比與蒸餾時間處理化合物成分和含量差異較大。

圖2 鳳丹花瓣9個提取物樣品主成分三維空間分布Fig. 2 Three-dimensional spatial distribution of principal components of 9 extraction samples of Paeonia ostii petals

圖3 鳳丹花瓣9個提取物樣品中化合物聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of compounds in 9 extraction samples of Paeonia ostii petals

3 結論與討論

從鳳丹牡丹3個發(fā)育時期的花瓣中，通過不同蒸餾工藝共鑒定出 145個揮發(fā)性成分，早期(S1)花瓣中的化合物種類豐富，后期(S2和S3)花瓣中的化合物含量比較高。檢測到的揮發(fā)性成分歸為8大類，分別是醇類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷烴類、酯類和其他類。S1期花瓣檢測到化合物占比最大的是其他類，中后期(S2和S3)占比最大的是烷烴類。從蒸餾工藝來看，同一發(fā)育時期，不同料液比和蒸餾時間處理，提取的揮發(fā)性成分中不同種類化合物占比及含量會有差異。綜合整體測定結果，S1期的工藝選擇料液比1:1、蒸餾1 h提取的花露揮發(fā)性成分種類和含量較高，S2和S3期花瓣的提取工藝分別選擇料液比 1:3和 1:2、蒸餾 1 h為最佳。

在鳳丹不同發(fā)育時期的花瓣中，發(fā)現(xiàn)較多具有重要應用價值和廣泛發(fā)展前景的化合物。在S1時期單獨出現(xiàn)的化合物有14種，如α-松油醇，具有廣泛的用途，其廣泛存在于植物油中，具有多種抑菌活性[14]，也是重要的香料成分，同時也是魚腥草的功效成分之一[15]，并廣泛用于日化和食用香精。在S2時期，單獨出現(xiàn)的化合物有9種，其中 1,2-二羥基萘、2-環(huán)己烯醇含量最高，其次為十四酸乙酯，該化合物可用于日化香精；還檢測到少量的對二甲苯和亞油酸，對二甲苯是聚酯工業(yè)的重要原料[16]，亞油酸具有降低血脂、預防或減少心血管病的發(fā)病率，特別是對高血壓、高血脂冠心病等功效[17]。在S3時期單獨出現(xiàn)的化合物有16種，其中3,7-二甲基-1-辛醇在樣品22中含量很高，該化合物別名乙酸玫瑰酯，具有玫瑰香氣，在香水及其他香精中可作為增香劑[18]。橙花醇是花香氣重要成分，在鳳丹盛花期花瓣中沒有檢測到[1]，本研究在S1和S2期也沒有檢測到橙花醇，在S3期則檢測到高含量的橙花醇，又以樣品21 (料液比1:1，蒸餾3 h)含量最高；橙花醇亦是一種貴重的香料成分，對微生物具有一定抑制效果，可用于消毒劑和護膚品[19]。另外，3-蒈烯是鳳丹重要的香氣成分，并與芍藥香氣一致[20]，僅在S3期花瓣中檢測到，且在樣品22含量最高(料液比1:2，蒸餾1 h)。因此，選擇合適的發(fā)育時期和優(yōu)化的蒸餾工藝可以捕捉到關鍵化合物，并作為后期產品開發(fā)的特征風味化合物。

自從牡丹花瓣被批準為新資源食品原料以來，幼嫩花蕾及未開放的花蕾(S1～S3期)常用于摘取花蕊制作花蕊茶，其花瓣則作為廢渣丟棄。為了充分利用牡丹花瓣資源，本研究將鳳丹花蕾制作花蕊茶后剩余的花瓣進行蒸餾，對其小分子化合物成分、含量及蒸餾工藝進行系統(tǒng)研究，獲得多個重要的揮發(fā)性成分，并確定不同發(fā)育時期花瓣的最佳蒸餾工藝，可為后期產品開發(fā)提供科學依據。