武夷巖茶炭焙工藝對肉桂烏龍茶揮發(fā)性組分的影響

洪翠云，林廷好，高建設(shè)，林 曦，王國英，鄭明芬

(1. 福建省亞熱帶植物研究所 / 福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006；2. 廈門茶葉進(jìn)出口有限公司，福建 廈門 361013；3. 武夷山市戲水巖茶業(yè)有限公司，福建 武夷山 354302)

武夷巖茶是我國傳統(tǒng)名茶，屬于半發(fā)酵的烏龍茶類，以其“巖骨花香”的獨特韻味享譽海內(nèi)外。2006年，“武夷巖茶(大紅袍)制作技藝”被列入首批國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)代表性項目名錄，其傳統(tǒng)獨到的制作技藝主要在做青和焙火兩道工序[1—2]。武夷巖茶傳統(tǒng)烘焙常以炭火為熱能，有“武夷焙法，實甲天下”的美譽[2]。烏龍茶精制過程中的焙火工藝，可以促使在初制完成時形成的內(nèi)含物質(zhì)在熱的作用下經(jīng)美拉德反應(yīng)、氧化降解等進(jìn)一步發(fā)展，從而為終端產(chǎn)品感官品質(zhì)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。香氣是影響烏龍茶品質(zhì)的重要因子之一，在烏龍茶感官審評中權(quán)數(shù)為 0.30，僅次于滋味因子的 0.35[3]。Feng等[4]研究表明，利用同一茶樹品種相同原料加工制成的六大茶類中，烏龍茶類揮發(fā)性組分的數(shù)量居六大茶類之首。近年來，關(guān)于電熱焙火工藝對烏龍茶揮發(fā)性組分及品質(zhì)的研究多有報道，且在揮發(fā)性代謝物的提取上存在蒸餾萃取法(SDE)、固相微萃取法(SPME)、頂空進(jìn)樣法(HS)等多種方式[5—6]。陳林等[7]比較了蒸餾萃取法(SDE)和頂空固相微萃取法(HS-SPME)對烏龍茶香氣組分的萃取效率，以HS-SPME干樣萃取法檢出成分的種類最多。目前，HS-SPME結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)在茶葉香氣組分的檢測中應(yīng)用廣泛，技術(shù)較為成熟，且具有操作簡單、靈敏度高、無需采用有機試劑且重現(xiàn)性好等優(yōu)點[8]。本研究采用 HS-SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)，以武夷巖茶當(dāng)家茶樹品種肉桂(Camellia sinensis‘Rougui’)鮮葉制成的烏龍茶為試材[9]，探討武夷巖茶炭焙工藝對肉桂烏龍茶揮發(fā)性組分及香氣品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 茶樣制備

2020年5月初，采摘自武夷山市行政區(qū)域范圍內(nèi)肉桂茶樹品種中等開面新梢茶青原料，按武夷巖茶傳統(tǒng)制作技藝初制成毛凈茶，并依據(jù)武夷巖茶精制習(xí)慣，前后經(jīng)3輪炭焙、退火，取不同炭焙程度實驗樣品。經(jīng)過一輪炭焙的實驗樣品，其成茶火功風(fēng)格為輕火(QH)；經(jīng)過二輪炭焙的實驗樣品，其成茶火功風(fēng)格為中火(ZH)；經(jīng)過三輪炭焙的實驗樣品，其成茶火功風(fēng)格為高火(GH)。不同炭焙程度實驗樣品，分別重復(fù)3次取樣。

肉桂烏龍茶初制、精制實驗均在武夷山市戲水巖茶業(yè)有限公司進(jìn)行。焙窟直徑58 cm、深度35 cm，使用荔枝炭，放炭量50 kg，焙茶量4 kg。炭焙工藝參數(shù)見表1。

表1 武夷肉桂烏龍茶炭焙工藝參數(shù)Table 1 Charcoal baking process parameters of Wuyi Rougui oolong tea

1.2 儀器與試劑

球磨儀，型號MM400(Retsch公司)；電子天平，型號MS105DU(METTLER TOLEDO公司)；萃取頭，型號 120 μm DVB/CAR/ PDMS(Agilent公司)；固相微萃取裝置，型號SPME AllowCond(CTC Analytics AG公司)；老化裝置，型號 Fiber Conditioning Station(CTC Analytics AG公司)；樣品加熱箱，型號Agitator(CTC Analytics AG 公司)；GC-MS，型號8890-5977B(Agilent公司)；色譜柱，型號 DB-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)(Agilent公司)。

氯化鈉分析純(國藥集團)；正已烷色譜純(Merck公司)；氘代苯乙酮(上海玉博)。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

取出樣品進(jìn)行液氮研磨，渦旋混合均勻，稱取0.6 g于頂空瓶中，分別加入1 mL飽和NaCl溶液、10 μL 50 μg·mL–1氘代苯乙酮溶液，并進(jìn)行全自動頂空固相微萃取(HS-SPME)。

全自動頂空固相微萃取條件：在100 ℃恒溫條件下，震蕩5 min，而后將120 μm DVB/CAR/ PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶，頂空萃取15 min，于250 ℃下解析 5 min，并進(jìn)行 GC-MS分離鑒定。120 μm DVB/CAR/ PDMS萃取頭在首次萃取前，于GC進(jìn)樣口中老化2 h，之后每次使用前加熱老化5 min。

1.3.2 色譜、質(zhì)譜采集條件

色譜條件：DB-5MS 毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm ×0.25 μm，Agilent J&W Scientific, Folsom, CA, 美國)，載氣為高純氦氣(純度不小于 99.999%)，流速1.0 mL·min–1，進(jìn)樣口溫度 250 ℃，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲3.5 min。程序升溫：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃·min–1升至 100 ℃，再以 7 ℃·min–1升至 180 ℃，最后以 25 ℃·min–1升至 280 ℃，保持 5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)譜接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為全掃描模式(SCAN)，質(zhì)量掃描范圍(m/z) 50～500 amu。

1.3.3 揮發(fā)性組分定性定量分析

GC-MS分析獲取的原始數(shù)據(jù)由 MassHunter軟件(Agilent)進(jìn)行峰提取，獲得特征峰的質(zhì)荷比、保留時間和峰面積等信息，并對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行以下處理：保留指數(shù)計算；對單個Peak過濾，只保留單組空值不多于 50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化及歸一化處理。在結(jié)合 NIST、Wiley等公共數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，建立MWGC 數(shù)據(jù)庫。采用 Qualitative Analysis Workflows B.08.00軟件，并基于MWGC數(shù)據(jù)庫，根據(jù)質(zhì)荷比、保留時間和峰面積等信息，對樣本揮發(fā)性成分進(jìn)行定性定量分析。圖1為不同質(zhì)控樣本QC總離子流圖(Total ions current，TIC)的重疊圖。質(zhì)控樣本(QC)由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同處理下的重復(fù)性。TIC為每個時間點質(zhì)譜圖中所有離子的強度加和后連續(xù)描繪得到的圖譜，TIC重疊圖可以判斷代謝物提取和檢測的重復(fù)性，即技術(shù)重復(fù)。

圖1 不同質(zhì)控樣本QC總離子流圖TIC重疊圖Fig. 1 Overlapping images of QC total ion current (TIC) for different quality control samples

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)采用 R軟件(www.r-project.org/)的內(nèi)置統(tǒng)計 Prcomp函數(shù)，設(shè)置參數(shù) scale=True，以對數(shù)據(jù)進(jìn)行 Unit variance scaling(UV)歸一化；通過R軟件Pheatmap包繪制熱圖，對揮發(fā)物在不同樣本間的組成模式進(jìn)行聚類分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)。正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)結(jié)合了正交信號矯正(OSC)和 PLS-DA方法，在原始數(shù)據(jù)進(jìn)行 log2轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行中心化處理(Mean Centering)，利用R軟件中的MetaboAnalyst R包OPLSR.Anal函數(shù)進(jìn)行計算分析。對OPLS-DA進(jìn)行排列檢驗?zāi)Ｐ万炞C，其P值均小于0.005，表示模型可靠，不存在過擬合現(xiàn)象。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同炭焙程度肉桂烏龍茶揮發(fā)性組分輪廓分析

實驗共檢測到樣本揮發(fā)性成分443個，其中包括96個雜環(huán)化合物、81個酯類化合物、31個萜類化合物、42個芳香烴類化合物、55個酮類化合物、24個其它烴類化合物、35個醇類化合物、24個醛類化合物、15個酚類化合物、14個胺類化合物、10個酸類化合物、5個含氮化合物、3個含硫化合物及其他化合物。

主成分分析是一種無監(jiān)督模式識別的多維數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法，常用來研究通過少數(shù)幾個主成分以揭示多個變量間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[10]。通過對不同炭焙處理肉桂烏龍茶揮發(fā)性組分主成分分析顯示，不同炭焙處理的樣本趨向分離，而相同炭焙處理的樣本趨于聚合，且質(zhì)控樣本位于坐標(biāo)圖的正中間位置，說明本實驗樣本處理具有代表性，且定量定性過程穩(wěn)定可靠(圖2)。其中，第一主成分PC1、第二主成分PC2分別解釋了樣本64.39%、12.77%的變異率。根據(jù)炭焙程度從低到高，樣本在第一主成分方向(X軸)上從左到右依次分布，說明炭焙程度是影響肉桂烏龍茶揮發(fā)性成分變化的重要因素。

圖2 不同炭焙處理肉桂烏龍茶揮發(fā)性組分的主成分分析得分Fig. 2 PCA score plot of the volatile components in Rougui oolong tea with different charcoal baking treatments

聚類分析同樣顯示，同一炭焙程度的樣本(組內(nèi))首先聚集在一起，其次再與鄰近炭焙程度的樣本(組間)聚集，與主成分分析結(jié)果基本一致(圖3)。

圖3 不同炭焙處理肉桂烏龍茶及質(zhì)控樣本揮發(fā)性組分聚類分析Fig. 3 Heat map of the volatile components in Rougui oolong tea with different charcoal baking treatments

2.2 不同炭焙程度肉桂烏龍茶與對照揮發(fā)性組分的差異分析

基于 OPLS-DA結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影(Variable importance in projection, VIP)，初步篩選出不同處理間的差異揮發(fā)性組分，同時結(jié)合單變量分析的P值及差異倍數(shù)值進(jìn)一步篩選出差異揮發(fā)性組分。本研究中，同時滿足VIP≥1、差異倍數(shù)值≥2或≤0.5，且P<0.05的 296個代謝物被篩選為差異揮發(fā)性組分，占所檢測的揮發(fā)性組分總數(shù)的66.82%，其中包括75個雜環(huán)化合物、45個酯類化合物、22個萜類化合物、33個芳香烴類化合物、37個酮類化合物、14個其他烴類化合物、16個醇類化合物、15個醛類化合物、13個酚類化合物、9個胺類化合物、4個含氮化合物、1個含硫化合物及其他，說明焙火工藝是烏龍茶揮發(fā)性成分含量高低的重要影響因素。烏龍茶精制烘焙過程中，在高溫作用下，茶葉內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生系列復(fù)雜反應(yīng)，如焦糖化反應(yīng)、美拉德反應(yīng)、氧化及熱裂解、異構(gòu)化等[11]。其中，美拉德反應(yīng)是高溫條件下茶葉中游離氨基酸及蛋白質(zhì)熱裂解產(chǎn)物游離胺等與糖類物質(zhì)熱裂解產(chǎn)生的醛、酮等羰基化合物發(fā)生縮合環(huán)化等的反應(yīng)；而在沒有氨基化合物存在時，糖類物質(zhì)受高溫作用發(fā)生脫水、縮合、聚合反應(yīng)，最后形成黑褐色物質(zhì)，即焦糖化反應(yīng)[12]。

以毛凈茶(MT)為對照，與不同炭焙處理的肉桂烏龍茶揮發(fā)性組分做兩兩比較分析，包括 MT與QH(圖4: A)、MT 與 ZH(圖4: B)、MT 與 GH(圖4: C)比較。差異揮發(fā)性組分火山圖充分展示了揮發(fā)性組分在兩組樣品中的表達(dá)水平差異，及差異的顯著性(圖4)。圖4顯示，在MT與QH比較中，總的差異揮發(fā)性成分達(dá)154個，其中包括上調(diào)揮發(fā)性成分152個及下調(diào)揮發(fā)性成分2個；而在MT與ZH及MT與 GH的比較中，相應(yīng)的化合物數(shù)量分別是 233、220、13及284、257、27。兩兩比較差異揮發(fā)性組分火山圖表明，以毛凈茶(空白處理)為對照，隨炭焙程度增加，肉桂烏龍茶總的差異揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量增加，且含量水平顯著上調(diào)的差異揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量顯著高于下調(diào)的差異揮發(fā)性成分。同時，值得注意的是，隨著炭焙程度增加，含量水平顯著上調(diào)的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量與顯著下調(diào)的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量同時增加，說明烘焙工藝在香氣物質(zhì)積累的同時，也存在部分香氣物質(zhì)的損失。據(jù)Feng等[4]研究，茶葉加工過程中形成香氣的重要途徑為三類：1)美拉德反應(yīng)及氨基酸和烴類(碳?xì)浠衔?的降解；2)酶介導(dǎo)的氧化和水解；3)非酶促降解和氧化。Chen等[13]在烏龍茶貯藏過程中采用定期復(fù)焙的管理方式，發(fā)現(xiàn)在熱的作用下，黃酮苷類物質(zhì)水解、長鏈醇類和酸類物質(zhì)發(fā)生降解，并生成吡咯類物質(zhì)。徐邢燕等[14]在探討不同烘焙程度武夷肉桂烏龍茶品質(zhì)差異時報道，中火茶13個氨基酸組分含量均極顯著低于輕火茶。陳泉賓等[15]、江山等[16]研究亦表明，烏龍茶精制烘焙工藝使茶葉中茶多酚、氨基酸含量顯著減少，而糖類物質(zhì)則減少不顯著甚至增加，進(jìn)一步說明黃酮苷類物質(zhì)在熱的作用下發(fā)生水解，釋放出苷類配基(糖類物質(zhì))及醇類芳香物質(zhì)，彌補了烘焙過程中美拉德反應(yīng)底物糖類物質(zhì)的消耗，使其減少不明顯甚至增加。而黃酮苷類物質(zhì)、脂肪酸及氨基酸/糖類均是茶葉中重要的香氣前體物質(zhì)[4]。在烏龍茶加工中，因為茶葉中酶活性在初制工藝時已基本被破壞，因此，精制烘焙過程中，在熱的作用下，香氣物質(zhì)的積累主要來自美拉德反應(yīng)等熱化學(xué)作用及非酶促的降解和氧化，如黃酮苷類物質(zhì)的水解等。

圖4 揮發(fā)性組分在兩兩比較中的火山圖分析Fig. 4 Volcano map analysis of volatile components in paired comparisons

2.3 揮發(fā)性組分K均值聚類分析

為了研究揮發(fā)性組分在不同樣本中的相對含量變化趨勢，將296個差異揮發(fā)性成分相對含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和中心化處理，然后進(jìn)行 K均值聚類(K_means)分析。按變化趨勢不同，296個差異揮發(fā)性成分被劃分為12個類別，其中包括隨炭焙程度增加含量逐漸升高的Sub Class 1、2、3、6、7、8、10，及隨炭焙程度增加含量逐漸降低的 Sub Class 5(圖5)。數(shù)據(jù)顯示，隨炭焙程度增加含量顯著升高的差異揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量達(dá)232個，而含量顯著降低的差異揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量為29個。在隨炭焙程度增加含量升高的差異揮發(fā)性組分中，不同類別物質(zhì)的數(shù)量及其占所在物質(zhì)類別差異揮發(fā)性組分總數(shù)的比例分別為：雜環(huán)化合物 60個(80.00%)、酯類 39個(86.67%)、萜類 18個(81.82%)、芳香烴類 26個(78.79%)、酮類 31個(83.78%)、其他烴類 10個(71.43%)、醇類7個(43.75%)、醛類11個(73.33%)、酚類11個(84.62%)、胺類8個(8.89%)、含氮化合物4個(100.00%)及含硫化合物1個(100.00%)等；在隨炭焙程度增加含量降低的揮發(fā)性差異代謝物中，不同類別物質(zhì)的數(shù)量及其占所在物質(zhì)類別差異代謝物總數(shù)的比例分別為：雜環(huán)化合物4個(5.33%)、酯類2個(4.44%)、萜類 3個(13.64%)、芳香烴類 4個(12.12%)、酮類1個(2.70%)、其他烴類1個(7.12%)、醇類6個(37.5%)、醛類3個(20.00%)、酚類1個(7.69%)等。研究顯示，絕大多數(shù)物質(zhì)隨著炭焙程度增加含量顯著升高。美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物可以歸為三類：糖的脫水、降解產(chǎn)物，包括呋喃、吡喃酮、環(huán)戊烯、羰基化合物和酸；氨基酸降解產(chǎn)物；Strecker降解反應(yīng)產(chǎn)生的醛類化合物、硫化物；化合物間進(jìn)一步反應(yīng)所得到的香氣化合物，如吡咯、吡啶、咪唑、吡嗪、惡嘩、噻唑和羥醛化合物[17]。肉桂烏龍茶中隨炭焙程度增加，含量顯著升高的差異代謝物包括2,3,5-三甲基呋喃、2-甲基苯并呋喃、戊基呋喃、α-糠醛-α-呋喃甲胺、2-乙烯基- 3-乙基吡嗪、3,5-二乙基甲基吡嗪、甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、乙基吡嗪、乙酰吡嗪、5-甲基糠醛、2-羥甲基苯并咪唑、2-(3-噻吩基)吡啶、3,5-二甲基-1-丁基吡唑、3,4-二氫-6-甲基-2H-吡喃、2,5-二甲基嘧啶、異喹啉等。吡嗪類、糠醛類衍生物，及吡咯類、喹啉類、吡啶類等均是茶葉中具有烘炒香的物質(zhì)[12]。隨炭焙程度增加，以醇類物質(zhì)增加數(shù)量的比例最低，降低數(shù)量的比例最高，其中，烏龍茶中含量豐富的具有花果香氣的香葉醇、反式-橙花叔醇、植物醇(Sub Class 5)隨烘焙程度增加含量顯著降低。此外，(E)-3-己烯醇(Sub Class 6)隨炭焙程度增加，含量顯著增加。前人研究表明[12]，茶葉加工過程中，隨溫度升高，低沸點的具青草氣的順-3-己烯醇(又名青葉醇)在揮發(fā)的同時，部分由于異構(gòu)化作用，形成具有清香的(E)-3-己烯醇(反式青葉醇)，說明烏龍茶精制烘焙過程中，在熱的處理下，部分揮發(fā)性代謝物發(fā)生了異構(gòu)化。吲哚是烏龍茶中含量豐富且具有清新花香的呈香物質(zhì)，其含量隨炭焙程度增加而顯著降低。這與Yang等[18]在咖啡豆烘焙中的研究一致，吲哚可以作為輕度烘焙咖啡的揮發(fā)性標(biāo)記物。

圖5 不同炭焙處理肉桂烏龍茶揮發(fā)性差異代謝物K_means圖Fig. 5 K_means graphs of differential volatile metabolites in Rougui oolong tea with different charcoal baking treatments

本研究肉桂烏龍茶中苯甲醛、(Z)-芳樟醇氧化物、水楊酸甲酯隨炭焙程度增加，含量顯著升高；而香葉醇、反式-橙花叔醇、α-法尼烯、吲哚則隨炭焙程度增加，含量顯著降低。姚月明等[19]研究表明，肉桂烏龍茶含有較豐富的香葉醇、芳樟醇及其氧化物，且香葉醇、苯甲醇、2-苯乙醇、順-3-己烯酸乙烯酯、水楊酸甲酯、苯乙腈和正丁酸等香氣成分均高于水仙烏龍茶；近來的研究報道認(rèn)為，含量較高的香氣成分為反式-橙花叔醇、α-法尼烯、苯甲醛、水楊酸甲酯、芳樟醇氧化物、香葉醇、苯甲腈、吲哚等[20]。因此，絕大多數(shù)的揮發(fā)性差異代謝物含量隨炭焙程度增加顯著升高，顯然并不能代表芳香物質(zhì)總量的增加。而不同芳香物質(zhì)的濃度高低，也并不能等同于對茶葉總體香氣品質(zhì)的貢獻(xiàn)大小[4]。參考文獻(xiàn)資料[4,19—21]，以熱圖的形式部分展示不同炭焙處理肉桂烏龍茶中含量豐富且重要的揮發(fā)性成分的相對含量變化(圖6)。

圖6 不同炭焙處理的肉桂烏龍茶中含量豐富的揮發(fā)性成分Fig. 6 Heat map of the abundant volatile metabolites in Rougui oolong tea with different charcoal baking treatments

3 結(jié)論

本研究基于頂空固相微萃取法(HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)，探討武夷巖茶炭焙工藝對肉桂烏龍茶揮發(fā)性組分的影響。實驗共檢測到肉桂烏龍茶揮發(fā)性成分443個，經(jīng)主成分分析及聚類分析顯示，焙火工藝是影響烏龍茶揮發(fā)性成分含量的重要因子，第一主成分及第二主成分分別解釋了樣本揮發(fā)性組分64.39%、12.77%變異率。不同實驗處理揮發(fā)性組分與對照的差異分析及K均值聚類分析均顯示，隨著炭焙程度增加，不同類別物質(zhì)中多數(shù)揮發(fā)性代謝物含量隨之顯著升高，且以美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等具有茶葉烘炒香的吡嗪類化合物、糠醛類衍生物、吡咯類化合物最具代表性；同時，部分含量豐富且具有烏龍茶特殊花果香氣的醇類、萜烯類物質(zhì)如香葉醇、橙花叔醇、植物醇、α-法尼烯等，及具清新花香的吲哚含量顯著降低。大多數(shù)差異揮發(fā)性代謝物含量隨炭焙程度增加顯著升高，但并不代表芳香物質(zhì)總量的增加。研究表明，烏龍茶精制烘焙過程中，香氣物質(zhì)的積累主要來自熱作用下的美拉德反應(yīng)及非酶促的降解和氧化，如黃酮苷類水解等。