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    提高重組型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的研究現(xiàn)狀

    2015-10-25 07:02:22殷子斐王麗娜王園凌晨
    生物技術(shù)通報(bào) 2015年9期
    關(guān)鍵詞:衣殼蛋白酶體基因治療

    殷子斐王麗娜王園凌晨

    (1. 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué),上?!?00433;2.佛羅里達(dá)大學(xué),美國(guó)佛羅里達(dá)州 32610)

    提高重組型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的研究現(xiàn)狀

    殷子斐1王麗娜1王園1凌晨2

    (1. 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué),上海200433;2.佛羅里達(dá)大學(xué),美國(guó)佛羅里達(dá)州32610)

    重組型腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)載體是目前基因治療研究中常用的、非常有前景的載體之一。歐洲第一個(gè)批準(zhǔn)上市的基因治療藥物正是基于rAAV。然而,rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對(duì)有限,導(dǎo)致其治療成本過高;且過高劑量的rAAV可以激發(fā)人體的免疫反應(yīng),降低其療效。因此,如何提高rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率一直是基因治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。目前常用的提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法有:使用組織特異性強(qiáng)的血清型/變體、應(yīng)用蛋白酶體抑制劑、突變衣殼蛋白表面裸露氨基酸、增加單鏈DNA的第二鏈合成、構(gòu)建自身互補(bǔ)型雙鏈載體等。就這些方法各自的原理、應(yīng)用現(xiàn)狀及優(yōu)劣勢(shì)進(jìn)行系統(tǒng)地綜述。

    重組腺相關(guān)病毒載體;基因治療;轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

    腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)是一種無包被,直徑約22 nm的單鏈DNA病毒。它是一種非致病病毒,目前尚未發(fā)現(xiàn)與AAV相關(guān)的人類或其他哺乳類疾病。與其他基因治療載體相比,重組型腺相關(guān)病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)載體具有安全性好、免疫原性低、物理性質(zhì)穩(wěn)定、感染細(xì)胞譜廣等優(yōu)點(diǎn),可在體內(nèi)外有效介導(dǎo)外源基因長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá),被視為最有前途的基因治療載體之一。目前,rAAV已經(jīng)被用于血友病、先天性黑矇、囊性纖維變性等多項(xiàng)基因治療的臨床研究中[1-3]。此外,全球第一個(gè)基因治療藥物——Glybera已經(jīng)于2012年底批準(zhǔn)上市,主要用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳病,而它的載體正是AAV1。

    然而rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對(duì)較低,必須使用大量的病毒才能達(dá)到有效的治療效果,從而導(dǎo)致其治療費(fèi)用相對(duì)較高[4]。此外,過高劑量rAAV的衣殼蛋白會(huì)激發(fā)宿主的免疫排斥反應(yīng),限制基因治療載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[5,6]。因此,如何提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率成了近年來基因治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。由于目前已有學(xué)者針對(duì)如何通過調(diào)控免疫反應(yīng),增加rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述[5-9],故筆者現(xiàn)主要針對(duì)rAAV從進(jìn)入細(xì)胞到在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的各個(gè)環(huán)節(jié),探討能夠有效提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法,并對(duì)這些方法的原理及優(yōu)劣勢(shì)進(jìn)行分析。

    1 AAV基本生物學(xué)特征

    成熟的AAV衣殼是由VP1、VP2和VP3三種衣殼蛋白裝配而成,其分子量大小分別為87、73、62 kD,三者的分子數(shù)目比例約為1∶1∶10。野生型(wide-type,wt)AAV的基因組為單鏈(Single-stranded,ss)、約4 800個(gè)堿基的線形DNA,其兩末端為145個(gè)堿基組成的倒置末端重復(fù)序列(Inverted terminal repeat,ITR)。在ITR序列之間為病毒蛋白編碼區(qū),包含兩個(gè)開放閱讀框架,產(chǎn)生復(fù)制蛋白質(zhì)(Rep)、衣殼蛋白質(zhì)(Cap)和包裝激活蛋白質(zhì)(Assembly-activating protein,AAP)。基因治療載體rAAV僅僅保留了AAV基因組末端的ITR,而將Rep、Cap及AAP的基因以目的基因盒替代(圖1)。在ITR結(jié)構(gòu)中,有3段回文結(jié)構(gòu)和一段非回文結(jié)構(gòu),3段回文結(jié)構(gòu)形成發(fā)夾狀,非回文結(jié)構(gòu)為D序列,其中含有末端斷裂位點(diǎn)(Terminal resolution site,trs)。在AAV的復(fù)制過程中,其以自身3'-OH為引物,產(chǎn)生2個(gè)等長(zhǎng)的具有一個(gè)共價(jià)連接末端的復(fù)制中間體(子/母鏈)(圖1)。之后,Rep蛋白發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的作用,在母鏈trs處產(chǎn)生一個(gè)缺口。新產(chǎn)生的3'-OH作為DNA聚合酶底物,合成新的ITR。經(jīng)過新一輪復(fù)制,可形成一個(gè)新的單鏈AAV病毒基因及一個(gè)子/母鏈共存二聚體[1,2,10]。

    圖1 AAV結(jié)構(gòu)示意圖

    在AAV感染細(xì)胞的過程中,病毒顆粒不停地撞擊靶細(xì)胞,直至衣殼蛋白與細(xì)胞表面相應(yīng)的受體、共受體結(jié)合,借助于細(xì)胞內(nèi)吞作用形成內(nèi)含體進(jìn)入細(xì)胞,隨后因內(nèi)含體酸化后從內(nèi)含體中逸出,并向細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)輸,運(yùn)輸過程中,其衣殼蛋白表面會(huì)被磷酸化、泛素化,從而被蛋白酶體降解。未被降解而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的病毒顆粒逐漸脫殼,釋放出其中的ssDNA。ssDNA不能作為mRNA轉(zhuǎn)錄模板,必須進(jìn)一步合成為雙鏈(Double-stranded,ds)DNA,最終通過轉(zhuǎn)錄、翻譯過程實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)[1,11-14](圖2)。此外,也有報(bào)道高爾基體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與到了AAV在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[15]。

    圖2 AAV在細(xì)胞中的生物學(xué)過程示意圖

    2 提高腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法

    2.1 選擇組織特異性強(qiáng)的血清型/變體

    根據(jù)衣殼蛋白抗原的不同,AAV可以分為1-13個(gè)血清型,且不同血清型的組織靶向性不完全相同。通過系統(tǒng)注射和局部注射的方法,現(xiàn)已經(jīng)證實(shí):AAV3、AAV8和AAV9對(duì)肝臟靶向性較強(qiáng);AAV6、AAV8對(duì)心臟、胰腺的特異性突出;AAV4、AAV9對(duì)肺的特異性明顯;AAV2對(duì)腎的特異性較強(qiáng);AAV1、AAV2、AAV5和AAV9對(duì)腦組織的特異性較好;對(duì)骨骼肌選擇性較強(qiáng)的載體有AAV1、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9;另外,AAV2、AAV5對(duì)角膜的靶向性優(yōu)于其他血清型[16-18]。為了更加精確地針對(duì)特殊細(xì)胞群進(jìn)行治療,越來越多的研究者針對(duì)特定組織中的某一類細(xì)胞篩選rAAV不同血清型。例如,本課題組[19-21]的研究表明:rAAV3能使用人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體作為共受體,對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向性很強(qiáng);Markakis等[22]發(fā)現(xiàn)AAV5在神經(jīng)元蛋白陽性、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白陽性的細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最佳;Aschauer等[23]報(bào)道:rAAV8主要在腦星形細(xì)胞中表達(dá),而腦皮層神經(jīng)元是rAAV9的主要靶向組織。

    圖3 AAV文庫的構(gòu)建方法

    近年來,借助于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),通過點(diǎn)突變、DNA體外重組技術(shù)(DNA shuffling)、衣殼蛋白引入新肽段等方法,建立起了包含成千上萬種AAV變體的大型AAV文庫,為篩選靶向性更強(qiáng)的rAAV載體提供了有效的保障[24]。點(diǎn)突變技術(shù)是指應(yīng)用易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù),將單個(gè)或多個(gè)堿基進(jìn)行突變的方法。利用點(diǎn)突變技術(shù),可以將AAV中Cap基因序列進(jìn)行突變,從而形成一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)氨基酸不同的變體(圖3-A)。Perabo等[25]對(duì)rAAV2 Cap序列中353-767的氨基酸序列進(jìn)行了突變,產(chǎn)生了2.5×107個(gè)AAV變體,并從中進(jìn)一步篩選出了能夠降低被人血清抗體中和的變體。DNA體外重組(shuffling)技術(shù)是指使用核酸酶,將基因剪切后產(chǎn)生大量的片段,在此基礎(chǔ)上,使之互為引物和模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而發(fā)生基因重組。使用此技術(shù),將多種AAV的Cap序列剪切后,發(fā)生隨機(jī)重新組合,就可以產(chǎn)生大量的變體[26-28](圖3-B)。如Yang等[28]采用這種方法,建立了AAV文庫,并從中篩選出變體M41,其對(duì)心臟的靶向性與目前報(bào)道的心臟靶向性最強(qiáng)的rAAV9相當(dāng),且在肝臟中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)明顯較低。細(xì)胞表面特異性的受體是基因治療載體結(jié)合的位點(diǎn)。因此,如果AAV表面有與特異性受體結(jié)合的配體,那么,其靶向性將大大提高。隨機(jī)肽段插入法是指在目的基因中插入一段可表達(dá)特異性肽段的DNA序列。在AAV的Cap基因中,用直接結(jié)合法或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)突變等方法,可以在不影響AAV包裝的前提下在特定的位點(diǎn)插入一段能夠表達(dá)特異性肽段的DNA序列,從而形成大量新的AAV變體[29-31](圖3-C)。Müller等[30,31]使用這種方法建立了載體文庫,并從中篩選出的AAV9 變體對(duì)人臍帶血內(nèi)皮細(xì)胞的親和力為wtAAV9的200倍。

    值得指出的是,目前對(duì)于rAAV血清型/變體的篩選主要停留在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上,并不能直接地指導(dǎo)臨床應(yīng)用。例如,AAV8能夠靶向小鼠的肝臟細(xì)胞,卻在人的肝臟細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不高。因此,如何構(gòu)建更加能夠反映人的某種組織特異性的動(dòng)物模型,并在此基礎(chǔ)上篩選鑒定最佳的AAV血清型/變體,是亟需解決的問題。Lisowski 等[32]將一位患者的新鮮肝臟細(xì)胞接種在免疫缺陷的FRG小鼠肝臟上,從而構(gòu)建了人-鼠肝的雜合體。這種動(dòng)物模型對(duì)于AAV在肝臟疾病中的應(yīng)用具有極高的應(yīng)用價(jià)值,值得借鑒。其次,AAV文庫的出現(xiàn)為大規(guī)模篩選靶向性更強(qiáng)的載體提供了可能,但不同的方法建立的文庫中的變體的結(jié)構(gòu)、組織靶向性不盡相同。因此,有必要加大多個(gè)文庫間的比較,并從中篩選出對(duì)某一特定的組織靶向性最強(qiáng)的變體。此外,許多文庫面臨一個(gè)問題:大多數(shù)變體并不能有效地包裝rAAV載體。如何整合并優(yōu)化現(xiàn)有的構(gòu)建文庫方法,建立變體數(shù)量不龐大、但卻含有高效變體的文庫,也需要進(jìn)一步的研究。Marsic等[33]通過計(jì)算機(jī)模擬的方法,先根據(jù)AAV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),結(jié)合目前已知的150個(gè)變體,在不影響AAV衣殼蛋白包裝的前提下,僅針對(duì)衣殼蛋白表面的部分可變氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整,最終產(chǎn)生了大約8×105的rAAV2變體,大大減少了那些不能被包裝的AAV變體的產(chǎn)生。

    2.2 采用蛋白酶體抑制劑

    泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞降解錯(cuò)誤以及外源蛋白質(zhì)的主要途徑,在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用[34,35]。不僅如此,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)也在rAAV進(jìn)入宿主細(xì)胞后的生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要作用[36]。當(dāng)rAAV進(jìn)入細(xì)胞,離開內(nèi)含體之后,其衣殼蛋白被泛素化標(biāo)記。被泛素化標(biāo)記的rAAV會(huì)被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,導(dǎo)致rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率下降[37,38]。在這個(gè)機(jī)制被揭示后,關(guān)于應(yīng)用蛋白酶體抑制劑提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的報(bào)道相應(yīng)地增加。

    Duan等[37]最早報(bào)道:半胱氨酸蛋白酶抑制劑LLnL、泛素蛋白酶體抑制劑MG132等能明顯將rAAV2在支氣管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高10倍左右。Jennings等[39]以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者病變部位的人滑膜細(xì)胞為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑zLLL能夠明顯增加含有白介素IL-10治療基因的rAAV2的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外,蛋白酶體抑制劑MG132還可以提高rAAV在人黑色素瘤細(xì)胞M21、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87等多種腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[40]。

    硼替佐米(Bortezomib)是目前已經(jīng)被美國(guó)食品及藥品管理局批準(zhǔn)用于臨床的蛋白酶體抑制劑,主要用于多發(fā)性骨髓瘤的治療?,F(xiàn)有不少學(xué)者針對(duì)這個(gè)藥物在rAAV基因治療中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。Neukirchen等[41]研究發(fā)現(xiàn)Bortezomib可以明顯提高細(xì)胞中rAAV介導(dǎo)的p53基因的表達(dá)水平,且二者具有協(xié)同的抗非小細(xì)胞肺癌的作用;Monahan等[42]在使用含有第八凝血因子治療基因的rAAV2和rAAV8治療A型血友病的狗時(shí),同時(shí)注射了Bortezomib,結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅Bortezomib單次給藥就能使rAAV2和rAAV8的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別提高6倍和3倍,并能使血友病狗的凝血時(shí)間恢復(fù)正常,出血率降低90%。此外,研究顯示,一種新的蛋白酶抑制劑卡非佐米(Carfilzomib)能夠特異性地抑制糜蛋白酶樣蛋白酶體的活性,其提高rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[36]的效能與Bortezomib相當(dāng)。

    目前在rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率研究中常用的蛋白酶體抑制劑大多為化學(xué)合成,但從中藥中分離的一些化合物也有抑制蛋白酶體活性的作用,可提高rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[43-45]。Zhang等[43]發(fā)現(xiàn)從中藥雷公藤中提取出來的單體——雷公藤紅素可以明顯在細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后增加前脂肪細(xì)胞3T3-L1中rAAV1的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,其原因是雷公藤紅素可以抑制蛋白酶體活性,增加rAAV入核。Wang等[44]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素的結(jié)構(gòu)類似物——扁塑藤素也能通過同樣的機(jī)制在體內(nèi)外提高rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,且扁塑藤素的作用較雷公藤紅素強(qiáng)。

    蛋白酶體抑制劑在提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的同時(shí),它們的毒性作用也必須引起注意。例如,Bortezomib可導(dǎo)致胃腸道不適、周圍神經(jīng)病變、心力衰竭等不良反應(yīng),不少患者不得不減少使用劑量,甚至終止治療[46-48],因此,在利用蛋白酶體抑制劑聯(lián)合rAAV治療疾病時(shí),必須盡可能地將蛋白酶體的劑量控制在安全、有效的范圍內(nèi)。與此同時(shí),現(xiàn)已證明一些中藥單體具有蛋白酶體抑制劑的活性,能提高rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,這為新的蛋白酶體抑制劑的研發(fā)開辟了新的方向,但是,也必須對(duì)它們的毒副作用進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估。

    2.3 衣殼蛋白定點(diǎn)突變

    在研究泛素化-蛋白酶體對(duì)rAAV影響時(shí),Yan等[38]發(fā)現(xiàn),經(jīng)熱處理的衣殼蛋白更容易被泛素化,提示衣殼蛋白在泛素化之前可能發(fā)生了構(gòu)象變化或經(jīng)歷了某種修飾。隨后,Zhong等[12,49,50]研究顯示,細(xì)胞內(nèi)的上皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(Epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase,EGFR-PTK)能夠?qū)AAV衣殼蛋白表面酪氨酸(Tyrosine,Y)殘基磷酸化,磷酸化的衣殼蛋白將通過泛素化-蛋白酶體途徑被降解,導(dǎo)致rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率降低。兩年后,同一課題組對(duì)rAAV2衣殼蛋白中的表面裸露的7個(gè)酪氨酸(Y)殘基位點(diǎn)突變成苯丙氨酸(Phenylalanine,F(xiàn)),各個(gè)突變體均能有效提高rAAV2的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,且Y730F能夠分別在HeLa細(xì)胞和小鼠肝臟中的將轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高10、30倍,能在小鼠體內(nèi)將治療血友病基因的第九凝血因子的表達(dá)效率提高10倍[12]。在此基礎(chǔ)上,該課題組還嘗試對(duì) rAAV多個(gè)酪氨酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變,結(jié)果顯示,AAV2-3M(Y444+500+730F)在小鼠肝臟細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較AAV2單個(gè)位點(diǎn)的突變體高3倍,較wtAAV2提高至少30倍[51]。此外,Qi 等[52]對(duì)rAAV2同時(shí)進(jìn)行了3個(gè)和6個(gè)位點(diǎn)的突變,結(jié)果顯示:新構(gòu)建的突變體AAV2-6M(Y252+272+444+500+704+730F)在腎小管上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高。關(guān)于通過Y殘基定點(diǎn)突變提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的研究主要集中在AAV2上,但這項(xiàng)技術(shù)對(duì)AAV6等血清型也適用[53]。不僅如此,衣殼蛋白Y殘基定點(diǎn)突變還能進(jìn)一步提高AAV變體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。如Klimczak等[54]對(duì)AAV變體ShH10進(jìn)行定點(diǎn)突變(Y445F),新的載體在Müller細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較ShH10進(jìn)一步提高,且能實(shí)現(xiàn)治療基因——膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在視網(wǎng)膜中的穩(wěn)定表達(dá),減緩大鼠視網(wǎng)膜退行性變的病情進(jìn)展[55]。

    雖然,目前的衣殼蛋白突變大多將Y殘基進(jìn)行突變,但是Aslanidi等[56]用絲氨酸(Serine,S)/蘇氨酸(Threonine,T)蛋白激酶JNK、p38MAPK處理細(xì)胞后,攜帶有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP) 報(bào) 告 基 因 的rAAV2在細(xì)胞中基因表達(dá)明顯增高,這表明對(duì)衣殼蛋白表面暴露的S和/或T磷酸化能降低病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在此基礎(chǔ)上,該課題組分別對(duì)AAV2衣殼蛋白上的S、T位點(diǎn)進(jìn)行突變,結(jié)果發(fā)現(xiàn),將S或T突變成纈氨酸(Valine V)的rAAV2載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更強(qiáng)[56,57]。

    對(duì)rAAV衣殼蛋表面的Y、S、T殘基進(jìn)行定點(diǎn)突能顯著提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,這種技術(shù)已經(jīng)被越來越多的學(xué)者證實(shí)并采納[58-61]。然而,衣殼蛋白突變不一定對(duì)所有的血清型有效。例如,Qiao等[62]構(gòu)建了突變體AAV8(Y447F、Y733F)、AAV9(Y446F、Y731F),結(jié)果顯示,突變后的AAV與wtAAV在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率上并無明顯差別。這究竟是突變位點(diǎn)不佳,還是衣殼蛋白定點(diǎn)突變的方法對(duì)這兩種血清型無效,尚待進(jìn)一步的分析。其次,衣殼蛋白上能被磷酸化的位點(diǎn)有很多,但究竟對(duì)哪個(gè)位點(diǎn)、多少個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變,是突變某一種氨基酸還是多種氨基酸的殘基位點(diǎn),才能獲得具有最強(qiáng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的突變體,還需要深入的研究來證實(shí)。目前,已經(jīng)有學(xué)者針對(duì)這個(gè)問題進(jìn)行了初步的嘗試,結(jié)果顯示,AAV2-4M(Y444+500+730F+T491V)突變體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比突變體AAV2-3M(Y444+500+730F)還高2-3倍[57]。然而,這樣的突變組合對(duì)于其他血清型的rAAV是否適用,還需要進(jìn)一步的分析。

    2.4 增加第二鏈的合成

    雖然wtAAV能感染多種哺乳類細(xì)胞,但在缺乏輔助病毒或其他輔助因子情況下,其自身基因表達(dá)幾乎檢測(cè)不到。同樣的,rAAV自身介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低下。其中一個(gè)重要原因是其ssDNA必須變成dsDNA才能完成轉(zhuǎn)錄和翻譯,這個(gè)DNA第二鏈合成rAAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的限速環(huán)節(jié)[63]。

    單鏈D序列結(jié)合蛋白(Single-stranded D-sequence-binding protein,ssD-BP)在rAAV基因組第二鏈合成的過程中發(fā)揮著重要的作用。Qing等[11,64,65]在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn),當(dāng)ssD-BP的Y殘基位點(diǎn)被EGFR-PTK磷酸化后,它能與AAV基因組中的ITR中的D序列結(jié)合,從而導(dǎo)致DNA從3'端的復(fù)制受阻,影響dsDNA的合成。隨后的研究表明:ssD-BP中的部分氨基酸序列與一種細(xì)胞內(nèi)源性的可與免疫抑制藥物FK506結(jié)合的蛋白(FK506-binding protein 52,F(xiàn)KBP52)相同。除了Y磷酸化,S或T磷酸化的FKBP52亦能顯著抑制rAAV基因組的第二鏈合成[66]。

    隨著以上機(jī)制的揭示,關(guān)于通過調(diào)控FKBP52去磷酸化從而增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法也逐漸增多。如Qing等[67]發(fā)現(xiàn)Y磷酸化的FKBP52是T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶(T-cell protein tyrosine phosphatase,TC-PTP)的底物。HeLa細(xì)胞和小鼠過表達(dá)TC-PTP后,F(xiàn)KBP52的磷酸化程度顯著降低,伴隨著ssAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯提升;Zhong 等[68]將TC-PTP基因包裝進(jìn)入rAAV組成新的病毒載體rAAV-TC-PTP,并將其與攜帶有報(bào)告基因的ssAAV病毒載體同時(shí)感染細(xì)胞,這種共感染的方法能安全有效的提高ssAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率;Zhao等[69]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞磷酸酶5(Protein phosphatase 5,PP5)能夠介導(dǎo)FKBP52在S或T殘基上的去磷酸化,增加單鏈rAAV的第二鏈合成;Jayandharan等[70]用3種rAAV載體共同感染小鼠,即攜帶有報(bào)告基因的ssAAV,過表達(dá)TC-PTP及PP5的病毒載體。這種方法能使靶細(xì)胞內(nèi)FKBP52的Y、S、T殘基均去磷酸化,最大程度降低第二鏈合成的抑制作用,結(jié)果顯示,該方法使ssAAV的報(bào)告基因在小鼠肝臟中的表達(dá)效率提高了16倍。Ma等[71]在傳統(tǒng)的三質(zhì)粒包裝rAAV的基礎(chǔ)上,增加了含有PP5基因的質(zhì)粒,這樣包裝純化后的病毒含有rAAV2-EGFP和rAAV2-PP5兩種病毒,這種混合的病毒在體內(nèi)外的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較單獨(dú)的rAAV2-EGFP高5-10倍。

    ssD-BP、FKBP52的發(fā)現(xiàn)闡明了ssAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有限的根本原因,TC-PTP、PP5的應(yīng)用能夠使FKBP52殘基去磷酸化,從而將抑制第二鏈合成的作用降低,增加rAAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率。然而,需要注意的是,雖然通過構(gòu)建過表達(dá)TC-PTP、PP5基因的細(xì)胞或小鼠,有助于闡明其作用機(jī)制,但是過表達(dá)這些基因?qū)?xì)胞或小鼠的生理功能是否有影響,目前尚無確切的研究報(bào)道。其次,直接將攜帶有TC-PTP、PP5基因的輔助rAAV注射到人體內(nèi),其安全性同樣也需要深入評(píng)估。

    2.5 將單鏈病毒載體改造成自身互補(bǔ)型雙鏈載體

    自然條件下存在的AAV的基因組是ssDNA。雖然人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了影響其第二鏈合成的關(guān)鍵酶,并且可以通過對(duì)關(guān)鍵酶的調(diào)控增加rAAV轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率,但將傳統(tǒng)ss rAAV病毒載體直接改造成ds載體,則能更加快速有效地提高rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

    早在2001年,McCarty等[72]將原來的rAAV2的包裝的基因組的長(zhǎng)度從4 474堿基減少至2 299堿基,首次分離了自身互補(bǔ)性(Self-complementary,sc)的rAAV載體,這種scAAV一端為正常的ITR,另一端為ITR的二聚體,中間的基因組是互補(bǔ)的雙鏈,從而解除了在ssAAV病毒載體基因表達(dá)過程中合成第二鏈的限制。體外研究證實(shí),scAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是ssAAV的5-190倍。隨后不久,McCarty[73]等進(jìn)一步研究表明:只要去除rAAV的一端的ITR的trs,就能避免末端ITR在復(fù)制后被Rep蛋白質(zhì)剪切。這個(gè)新合成的DNA會(huì)在分子內(nèi)部通過堿基配對(duì)的作用進(jìn)行折疊,從而形成scAAV載體。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示:ssAAV2在小鼠肝臟中的表達(dá)效率僅有5%-10%,而scAAV2的表達(dá)效率卻高達(dá)25%-50%。此后,Wang等[74]進(jìn)一步將一端ITR中的部分D序列和trs一起刪除,合成雙鏈的scAAV2。這種新的rAAV載體不僅能在體外實(shí)現(xiàn)對(duì)黑色素瘤、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因表達(dá),并能在體內(nèi)肝臟中高效表達(dá)轉(zhuǎn)基因,并維持長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月。

    這種新型的scAAV較傳統(tǒng)的ssAAV的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率大幅提高,可用于多種血清型、多種疾病的基因治療中。例如,Nathwani等[75]研究發(fā)現(xiàn):scAAV8能夠快速地在細(xì)胞中形成有活性的雙鏈線性基因組,并使人凝血因子IX的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較ssAAV提高20倍左右,更加有效地糾正小鼠的出血狀態(tài);Gao等[76]合成的scAAV7、scAAV8在食蟹獼猴的肝臟細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較傳統(tǒng)ssAAV2有2個(gè)指數(shù)倍數(shù)的提高;Liu等[77]將scAAV2直接注射到大鼠感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、紅核、背根神經(jīng)節(jié),結(jié)果顯示這些地方沿著軸突有很強(qiáng)的報(bào)告基因表達(dá)。

    然而,scAAV也有著一定的局限性。首先,scAAV提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是建立在犧牲基因裝載容量的基礎(chǔ)之上的,因?yàn)閭鹘y(tǒng)的ssAAV能包裝約4 500堿基的基因,而scAAV載體的基因裝載量只有2 300堿基左右,約為ssAAV的一半,這并不適合杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良等治療基因較長(zhǎng)的疾??;其次,雖然目前研究者們已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)了scAAV在肝臟、肌肉、骨髓、眼等多種組織和細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo),但并非所有細(xì)胞都能被scAAV感染[78]。如Ding等分別使用攜帶有報(bào)告基因的scAAV2、ssAAV2、scAAV5、ssAAV5感染人極化氣道上皮細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)scAAV與ssAAV之間沒有區(qū)別,這說明可能在某些細(xì)胞中,從單鏈合成雙鏈并非轉(zhuǎn)基因表達(dá)的限速環(huán)節(jié)[78,79]。再次,scAAV較ssAAV能夠激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。如Martino[80]等研究結(jié)果表明,與注射ssAAV后的小鼠相比,注射scAAV后的小鼠體內(nèi)的腫瘤壞死因子a、單核細(xì)胞趨化化蛋白1、g干擾素誘導(dǎo)蛋白等炎性因子明顯升高,且肝臟中的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞明顯增多,這說明scAAV較ssAAV對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)更強(qiáng);Wu 等[81]研究發(fā)現(xiàn),scAAV能夠較ssAAV明顯增加轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物特異的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。由于過強(qiáng)的免疫反應(yīng)不僅會(huì)導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生,降低后續(xù)基因治療的療效,且對(duì)機(jī)體也有損傷,因此,如何合理控制scAAV的使用劑量,在提高療效的同時(shí),保證機(jī)體的安全是亟需探討的。

    3 結(jié)語

    基因治療不僅是遺傳性疾病的最佳療法,也在腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病的治療中有著重要的價(jià)值。rAAV免疫源性低、感染譜廣,是目前基因治療領(lǐng)域中的熱門載體。然而,由于AAV血清型有限且對(duì)組織的靶向性不強(qiáng),AAV進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被蛋白酶體降解,且ssAAV必須實(shí)現(xiàn)向dsAAV的轉(zhuǎn)變才能完成基因的表達(dá),而第二鏈合成的過程在很大程度上受細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白抑制,rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不盡如人意,限制了其廣泛應(yīng)用。

    隨著研究的不斷深入,通過對(duì)AAV生命周期更加全面的了解,現(xiàn)已經(jīng)建立了一系列有效的提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法。野生型的AAV只有13種,但在現(xiàn)代分子技術(shù)上建立的AAV文庫包含了大量的變體,使載體數(shù)量有了幾何倍數(shù)的提高,這為將來篩選特異性強(qiáng)的AAV載體提供了寶貴的資源;通過直接使用蛋白酶體抑制劑,或者對(duì)衣殼蛋白進(jìn)行定點(diǎn)突變,均可以顯著降低衣殼蛋白被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的識(shí)別,保障rAAV的轉(zhuǎn)基因表達(dá);TC-PTP、PP5的應(yīng)用可以將細(xì)胞中限制第二鏈合成的蛋白活性降低,加速rAAV載體在靶細(xì)胞中的第二鏈合成;新合成的scAAV載體則可以直接跳過合成雙鏈這個(gè)環(huán)節(jié),快速地實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯。除了目前最常用的這5類方法外,還可通過使用三氧化二砷增加細(xì)胞內(nèi)活性氧、紫外線改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、在rAAV的衣殼蛋白上連接化學(xué)基團(tuán)改變其對(duì)靶細(xì)胞的親和性等方法提高rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[63,82-84]。正是由于這些方法的發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證和應(yīng)用,rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大幅度提升,可用其進(jìn)行基因治療的疾病范圍也逐漸擴(kuò)大。目前,全球第一個(gè)以rAAV為載體的基因治療藥物——Glybera已經(jīng)于2012年上市,并且還有關(guān)于rAAV基因治療的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中,有望早日應(yīng)用于患者。

    在今后的研究中,需要注意的是,現(xiàn)報(bào)道的提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法部分尚處于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,能否安全、有效地應(yīng)用于臨床,還需要進(jìn)一步的判斷評(píng)估。本綜述中介紹的這些方法分別在rAAV衣殼蛋白與細(xì)胞綁定、胞內(nèi)運(yùn)輸與降解、基因復(fù)制與轉(zhuǎn)錄等環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用。因此,十分有必要將這些方法進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用,以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的最大化。可以采取以下策略,首先,在常規(guī)血清型和rAAV文庫的基礎(chǔ)上,篩選對(duì)某一特定組織靶向性最強(qiáng)的載體,并進(jìn)一步根據(jù)載體的結(jié)構(gòu),突變其表面的部分衣殼蛋白的氨基酸殘基,合成感染效率更佳的rAAV突變體;其次,若目的基因較小,則合成scAAV,若只能使用ssAAV,則可聯(lián)合含有TCPTP、PP5的rAAV同時(shí)應(yīng)用;最后,結(jié)合安全劑量下的蛋白酶抑制劑,實(shí)現(xiàn)目的基因的表達(dá)。事實(shí)上,在最近一次的乙型血友病臨床試驗(yàn)中,科學(xué)家們已經(jīng)將幾種方法聯(lián)合應(yīng)用,包括本文介紹的以及沒有介紹的,從而增加rAAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這些方法包括:轉(zhuǎn)基因DNA序列人源化、AAV8血清型、scDNA的基因組以及聯(lián)合使用免疫抑制劑地塞米松等[85]。相信在不遠(yuǎn)的將來,通過科研和臨床工作者們不斷的深入探索和有效的交流合作,rAAV可以為維護(hù)人類的健康作出更加重要的貢獻(xiàn)。

    [1]Grieger JC, Samulski RJ. Adeno-associated virus vectorology,manufacturing, and clinical applications[J]. Methods Enzymol,2012, 507:229-254.

    [2]Griesenbach U, Alton EW. Current status and future directions of gene and cell therapy for cystic fibrosis[J]. BioDrugs, 2011, 25(2):77-88.

    [3]Mingozzi F, High KA. Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV:progress and challenges[J]. Nat Rev Genet,2011, 12(5):341-355.

    [4]Tal J. Adeno-associated virus-based vectors in gene therapy[J]. J Biomed Sci, 2000, 7(4):279-291.

    [5]Masat E, Pavani G, Mingozzi F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy:challenges and potential solutions[J]. Discov Med, 2013, 15(85):379-389.

    [6]Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV in clinical trials[J]. Curr Gene Ther, 2011, 11(4):321-330.

    [7]Hareendran S, Balakrishnan B, Sen D, et al. Adeno-associated virus(AAV)vectors in gene therapy:immune challenges and strategies to circumvent them[J]. Rev Med Virol, 2013, 23(6):399-413.

    [8]Logan GJ, A lexander IE. Adeno-associated virus vectors:immunobiology and potential use for immune modulation[J]. Curr Gene Ther, 2012, 12(4):333-343.

    [9]刁勇, 許瑞安. 重組腺相關(guān)病毒載體誘導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)及機(jī)制[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2012, 52(5):550-557.

    [10]張鳳蘭, 文朝陽, 丁衛(wèi). 腺相關(guān)病毒基因治療載體的改良與應(yīng)用[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 30(4):565-572.

    [11]Qing K, Khuntirat B, Mah C, et al. Adeno-associated virus type 2-mediated gene transfer:correlation of tyrosine phosphorylation of the cellular single-stranded D sequence-binding protein with transgene expression in human cells in vitro and murine tissues in vivo[J]. J Virol, 1998, 72(2):1593-1599.

    [12]Zhong L, Li B, Mah CS, et al. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors:point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(22):7827-732.

    [13]Seisenberger G, Ried MU, Endress T, et al. Real-time singlemolecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus[J]. Science, 2001, 294(5548):1929-1932.

    [14]Nonnenmacher M, Weber T. Adeno-associated virus 2 infection requires endocytosis through the CLIC/GEEC pathway[J]. Cell Host Microbe, 2011, 10(6):563-576.

    [15]Johnson JS, Gentzsch M, Zhang L, et al. AAV exploits subcellular stress associated with inflammation, endoplasmic reticulum expansion, and misfolded proteins in models of cystic fibrosis[J]. PLoS Pathog, 2011, 7(5):e1002053.

    [16]Wu Z, Asokan A, Samulski RJ. Adeno-associated virus serotypes:vector toolkit for human gene therapy[J]. Mol Ther, 2006, 14(3):316-327.

    [17]Gao GP, Alvira MR, Wang L, et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(18):11854-11859.

    [18]Miyake K, Miyake N, Yamazaki Y, et al. Serotype-independent method of recombinant adeno-associated virus(AAV)vector production and purification[J]. J Nippon Med Sch, 2012, 79(6):394-402.

    [19]Ling C, Lu Y, Cheng B, et al. High-efficiency transduction of liver cancer cells by recombinant adeno-associated virus serotype 3 vectors[J]. J Vis Exp, 2011, (49):doo:10.3791/2538.

    [20]Ling C, Lu Y, Kalsi JK, et al. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3[J]. Hum Gene Ther, 2010, 21(12):1741-1747.

    [21]Cheng B, Ling C, Dai Y, et al. Development of optimized AAV3 serotype vectors:mechanism of high-efficiency transduction of human liver cancer cells[J]. Gene Ther, 2012, 19(4):375-384.

    [22]Markakis EA, Vives KP, Bober J, et al. Comparative transduction efficiency of AAV vector serotypes 1-6 in the substantia nigra and striatum of the primate brain[J]. Mol Ther, 2010, 18(3):588-593.

    [23]Aschauer DF, Kreuz S, Rumpel S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2,5, 6, 8 and 9 in the mouse brain[J]. PLoS One, 2013, 8(9):e76310.

    [24]Bartel MA, Weinstein JR, Schaffer DV. Directed evolution of novel adeno-associated viruses for therapeutic gene delivery[J]. GeneTher, 2012, 19(6):694-700.

    [25]Perabo L, Endell J, King S, et al. Combinatorial engineering of a gene therapy vector:directed evolution of adeno-associated virus[J]. J Gene Med, 2006, 8(2):155-162.

    [26]Gray SJ, Blake BL, Criswell HE, et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus(AAV)vector that crosses the seizurecompromised blood-brain barrier(BBB)[J]. Mol Ther, 2010,18(3):570-578.

    [27]Kienle E, Senis E, B?rner K, et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus(AAV)gene therapy vectors via DNA family shuffling[J]. J Vis Exp, 2012, (62). pii:3819. doi:10.3791/3819

    [28]Yang L, Jiang J, Drouin LM, et al. A myocardium tropic adenoassociated virus(AAV)evolved by DNA shuffling and in vivo selection[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(10):3946-3951.

    [29]Koerber JT, Schaffer DV. Transposon-based mutagenesis generates diverse adeno-associated viral libraries with novel gene delivery properties[J]. Methods Mol Biol, 2008:434161-434170.

    [30]Muller OJ, Kaul F, Weitzman MD, et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors[J]. Nat Biotechnol, 2003, 21(9):1040-1046.

    [31]Varadi K, Michelfelder S, Korff T, et al. Novel random peptide libraries displayed on AAV serotype 9 for selection of endothelial cell-directed gene transfer vectors[J]. Gene Ther, 2012, 19(8):800-809.

    [32]Lisowski L, Dane AP, Chu K, et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model[J]. Nature, 2014, 506(7488):382-386.

    [33]Marsic D, Govindasamy L, Currlin S, et al. Vector design tour de force:integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants[J]. Mol Ther, 2014, 22(11):1900-1909.

    [34]Engel K, Bassermann F. The ubiquitin proteasome system and its implications for oncology[J]. Dtsch Med Wochenschr, 2013, 138(22):1178-1182.

    [35]Shen M, Schmitt S, Buac D, et al. Targeting the ubiquitinproteasome system for cancer therapy[J]. Expert Opin Ther Targets, 2013, 17(9):1091-1108.

    [36]M itchell AM, Samu lski RJ. Mechanistic insights into the enhancement of adeno-associated virus transduction by proteasome inhibitors[J]. J Virol, 2013, 87(23):13035-13041.

    [37]Duan D, Yue Y, Yan Z, et al. Endosomal processing lim its gene transfer to polarized airway epithelia by adeno-associated virus[J]. J Clin Invest, 2000, 105(11):1573-1587.

    [38]Yan Z, Zak R, Luxton GW, et al. Ubiquitination of both adenoassociated virus type 2 and 5 capsid p roteins affects the transduction efficiency of recombinant vectors[J]. J Virol, 2002,76(5):2043-2053.

    [39]Jennings K, Miyamae T, Traister R, et al. Proteasome inhibition enhances AAV-mediated transgene exp ression in human synoviocytes in vitro and in vivo[J]. Mol Ther, 2005, 11(4):600-607.

    [40]Przystal JM, Umukoro E, Stoneham CA, et al. Proteasome inhibition in cancer is associated with enhanced tumor targeting by the adenoassociated virus/phage[J]. Mol Oncol, 2013, 7(1):55-66.

    [41]Neukirchen J, Meier A, Rohrbeck A, et al. The proteasome inhibitor bortezomib acts differently in combination with p53 gene transfer or cytotoxic chemotherapy on NSCLC cells[J]. Cancer Gene Ther,2007, 14(4):431-439.

    [42]Monahan PE, Lothrop CD, Sun J, et al. Proteasome inhibitors enhance gene delivery by AAV virus vectors expressing large genomes in hemophilia mouse and dog models:a strategy for broad clinical application[J]. Mol Ther, 2010, 18(11):1907-1916.

    [43]Zhang FL, Jia SQ, Zheng SP, et al. Celastrol enhances AAV1-mediated gene expression in mice adipose tissues[J]. Gene Ther, 2011, 18(2):128-134.

    [44]Wang LN, Wang Y, Lu Y, et al. Pristimerin enhances recombinant adeno-associated virus vector-mediated transgene expression in human cell lines in vitro and murine hepatocytes in vivo[J]. J Integr Med, 2014, 12(1):20-34.

    [45]Ling C, Wang Y, Zhang Y, et al. Selective in vivo targeting of human liver tumors by optimized AAV3 vectors in a murine xenograft model[J]. Hum Gene Ther, 2014, 25(12):1023-1034.

    [46]Rampen A J, Jongen J L, van Heuvel I, et al. Bortezomib-induced polyneuropathy[J]. Neth J Med, 2013, 71(3):128-133.

    [47]Voortman J, Giaccone G. Severe reversible cardiac failure after bortezomib treatment combined with chemotherapy in a non-small cell lung cancer patient:a case report[J]. BMC Cancer, 2006, (6):129.

    [48]Petrucci MT, Giraldo P, Corradini P, et al. A prospective,international phase 2 study of bortezomib retreatment in patients with relapsed multiple myeloma[J]. Br J Haematol, 2013, 160(5):649-659.

    [49]Zhong L, Zhao W, Wu J, et al. A dual role of EGFR protein tyrosine kinase signaling in ubiquitination of AAV2 capsids and viral second-strand DNA synthesis[J]. Mol Ther, 2007, 15(7):1323-1330.

    [50]Zhong L, Li B, Jayandharan G, et al. Tyrosine-phosphorylation of AAV2 vectors and its consequences on viral intracellular trafficking and transgene expression[J]. Virology, 2008, 381(2):194-202.

    [51]Markusic DM, Herzog RW, Aslanidi GV, et al. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines[J]. Mol Ther, 2010, 18(12):2048-2056.

    [52]Qi YF, Li QH, Shenoy V, et al. Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2013, 40(1):53-55.

    [53]Qiao C, Zhang W, Yuan Z, et al. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle[J]. Hum Gene Ther, 2010, 21(10):1343-1348.

    [54]Klimczak RR, Koerber JT, Dalkara D, et al. A novel adenoassociated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells[J]. PLoS One, 2009, 4(10):e7467.

    [55]Dalkara D, Kolstad KD, Guerin KI, et al. AAV mediated GDNF secretion from retinal glia slows down retinal degeneration in a rat model of retinitis pigmentosa[J]. Mol Ther, 2011, 19(9):1602-1608.

    [56]Aslanidi GV, Rivers AE, Ortiz L, et al. High-efficiency transduction of human monocyte-derived dendritic cells by capsid-modified recombinant AAV2 vectors[J]. Vaccine, 2012, 30(26):3908-3917.

    [57]Aslanidi GV, Rivers AE, Ortiz L, et al. Optimization of the capsid of recombinant adeno-associated virus 2(AAV2)vectors:the final threshold?[J]. PLoS One, 2013, 8(3):e59142.

    [58]Zolotukhin I, Luo D, Gorbatyuk O, et al. Improved adeno-associated viral gene transfer to murine glioma[J]. J Genet Syndr Gene Ther, 2013, 4(133):12815.

    [59]Dai X, Han J, Qi Y, et al. AAV-mediated lysophosphatidylcholine acyltransferase 1(Lpcat1)gene replacement therapy rescues retinal degeneration in rd11 mice[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2014, 55(3):1724-1734.

    [60]Hakim CH, Yue Y, Shin JH, et al. Systemic gene transfer reveals distinctive muscle transduction profile of tyrosine mutant AAV-1, -6, and -9 in neonatal dogs[J]. Mol Ther Methods Clin Dev,2014, 1:14002.

    [61]Mowat FM, Gornik KR, Dinculescu A, et al. Tyrosine capsid-mutant AAV vectors for gene delivery to the canine retina from a subretinal or intravitreal approach[J]. Gene Ther, 2014, 21(1):96-105.

    [62]Qiao C, Yuan Z, Li J, et al. Single tyrosine mutation in AAV8 and AAV9 capsids is insufficient to enhance gene delivery to skeletal muscle and heart[J]. Human Gene Therapy, Part B:Methods,2012, 23(1):29-37.

    [63]Ferrari FK, Samulski T, Shenk T, et al. Second-strand synthesis is a rate-limiting step for efficient transduction by recombinant adenoassociated virus vectors[J]. J Virol, 1996, 70(5):3227-3234.

    [64]Qing K, Wang XS, Kube DM, et al. Role of tyrosine phosphorylation of a cellular protein in adeno-associated virus 2-mediated transgene expression[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(20):10879-10884.

    [65]Mah C, Qing K, Khuntirat B, et al. Adeno-associated virus type 2-mediated gene transfer:role of epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase in transgene expression[J]. J Virol, 1998,72(12):9835-9843.

    [66]Qing K, Hansen J, Weigel-Kelley KA, et al. Adeno-associated virus type 2-mediated gene transfer:role of cellular FKBP52 protein in transgene expression[J]. J Virol, 2001, 75(19):8968-8976.

    [67] Qing K, Li W, Zhong L, et al. Adeno-associated virus type 2-mediated gene transfer:role of cellular T-cell protein tyrosine phosphatase in transgene expression in established cell lines in vitro and transgenic mice in vivo[J]. J Virol, 2003, 77(4):2741-2746.

    [68]Zhong L, Chen L, Li Y, et al. Self-complementary adeno-associated virus 2(AAV)-T cell protein tyrosine phosphatase vectors as helper viruses to improve transduction efficiency of conventionalsingle-stranded AAV vectors in vitro and in vivo[J]. Mol Ther,2004, 10(5):950-957.

    [69]Zhao W, Wu J, Zhong L, et al. Adeno-associated virus 2-mediated gene transfer:role of a cellu lar serine/threonine p rotein phosphatase in augmenting transduction efficiency[J]. Gene Ther, 2007, 14(6):545-550.

    [70]Jayandharan GR, Zhong L, Li B, et al. Strategies for improving the transduction efficiency of single-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo[J]. Gene Ther, 2008, 15(18):1287-1293.

    [71]Ma W, Li B, Ling C, et al. A simple method to increase the transduction efficiency of single-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo[J]. Hum Gene Ther, 2011, 22(5):633-640.

    [72]McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis[J]. Gene Ther, 2001, 8(16):1248-1254.

    [73]McCarty DM, Fu H, Monahan PE, et al. Adeno-associated virus terminal repeat(TR)mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo[J]. Gene Ther, 2003, 10(26):2112-2118.

    [74]Wang Z, Ma HI, Li J, et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo[J]. Gene Ther, 2003, 10(26):2105-2111.

    [75]Nathwani AC, Gray JT, Ng CY, et al. Self-complementary adenoassociated virus vectors containing a novel liver-specific human factor IX expression cassette enable highly efficient transduction of murine and nonhuman primate liver[J]. Blood, 2006, 107(7):2653-2661.

    [76]Gao GP, Lu Y, Sun X, et al. High-level transgene expression in nonhuman primate liver with novel adeno-associated virus serotypes containing self-complementary genomes[J]. J Virol, 2006, 80(12):6192-6194.

    [77]Liu Y, Keefe K, Tang X, et al. Use of self-complementary adenoassociated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons:implications for axon regeneration[J]. PLoS One, 2014, 9(2):e87447.

    [78]McCarty DM. Self-complementary AAV vectors;advances and applications[J]. Mol Ther, 2008, 16(10):1648-1656.

    [79]Ding W, Yan Z, Zak R, et al. Second-strand genome conversion of adeno-associated virus type 2(AAV-2)and AAV-5 is not rate limiting following apical infection of polarized human airway epithelia[J]. J Virol, 2003, 77(13):7361-7366.

    [80]Martino AT, Suzuki M, Markusic DM, et al. The genome of selfcomplementary adeno-associated viral vectors increases Toll-like receptor 9-dependent innate immune responses in the liver[J]. Blood, 2011, 117(24):6459-6468.

    [81]Wu T, Topfer K, Lin S W, et al. Self-complementary AAVs induce more potent transgene product-specific immune responses compared to a single-stranded genome[J]. Mol Ther, 2012, 20(3):572-579.

    [82]Mitchell AM, Li C, Samulski RJ. Arsenic trioxide stabilizes accumulations of adeno-associated virus virions at the perinuclear region, increasing transduction in vitro and in vivo[J]. J Virol,2013, 87(8):4571-4583.

    [83]Le HT, Yu QC, Wilson JM, et al. Utility of PEGylated recombinant adeno-associated viruses for gene transfer[J]. J Control Release,2005, 108(1):161-177.

    [84]Ponnazhagan S, Mahendra G, Kumar S, et al. Conjugate-based targeting of recombinant adeno-associated virus type 2 vectors by using avidin-linked ligands[J]. J Virol, 2002, 76(24):12900-12907.

    [85]Nathwani AC, Tuddenham EG, Rangarajan S, et al. Adenovirusassociated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B[J]. N Engl J Med, 2011, 365(25):2357-2365.

    (責(zé)任編輯 狄艷紅)

    Research Advances on Increasing the Transduction Efficiency of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

    Yin Zifei1Wang Li’na1Wang Yuan1Ling Chen2
    (1. Second Military Medical University,People’s Liberation Army,Shanghai200433;2. University of Florida,F(xiàn)lorida32610)

    The recombinant adeno-associated virus(rAAV)vector has emerged as one of the promising and commonly-used vectors in gene therapy research. The first gene therapy drug in clinic approved in Europe is based on rAAV. Due to the relatively limited transduction efficiency, the cost of the rAAV-mediated treatment is expensive. Additionally, high dose of rAAV may trigger host immune response, resulting in the curative effect reduced. Therefore, how to enhance the transduction efficiency of rAAV has been a hot issue in gene therapy. Hitherto there are five common methods to achieve this goal:selecting tissue-specific tropism serotypes and variants, using proteasome inhibitors, mutating capsid surface-exposed amino-acids, increasing second-strand DNA synthesis, and producing self-complementary vectors. In this paper we systemically review the above methods from the aspects of principle, status of application, advantages and disadvantages.

    recombinant adeno-associated virus vector;gene therapy;transduction efficiency

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.007

    2014-11-04

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81303112)

    殷子斐,女,博士研究生,研究方向:中醫(yī)藥與基因治療的聯(lián)合應(yīng)用;E-mail:yinzifei870730smmu@163.com

    凌晨,男,博士,助理教授,研究方向:以腺相關(guān)病毒為載體的基因治療;E-mail:lingchen@peds.ufl.edu

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