短鏈全氟羧酸對(duì)小麥生長(zhǎng)的生態(tài)毒理效應(yīng)*

游 奎 鐘 喆 趙淑艷

(大連理工大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 盤錦 124221)

全氟化合物(PFASs)是化合物分子中與碳連接的氫原子被氟原子取代的一類人工合成的有機(jī)化合物[1]，因其具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、疏水疏油性和高表面活性而被廣泛應(yīng)用于消防、造紙與電鍍等工業(yè)和商業(yè)領(lǐng)域[2]。其中，全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)是PFASs的典型代表，在環(huán)境中檢出頻率較高[3]，在我國(guó)PFASs污染的土壤中，PFOA(0.03～2.32 ng/g)和PFOS(0.01～1.88 ng/g)污染水平也較嚴(yán)重[4]。PFOS具有極強(qiáng)的環(huán)境持久性、生物蓄積性和生物毒性[5]。

近年來(lái)，由于對(duì)以PFOA和PFOS為代表的中長(zhǎng)鏈PFASs的管控，短鏈PFASs作為長(zhǎng)鏈PFASs的替代物而被廣泛應(yīng)用[6]。上海城市污水中短鏈PFASs含量普遍高于長(zhǎng)鏈PFASs[7]。研究發(fā)現(xiàn)，上海市農(nóng)業(yè)區(qū)表層土壤樣品中全氟丙酸(PFPrA)、全氟丁酸(PFBA)、全氟戊酸(PFPeA)、全氟己酸(PFHxA)、全氟庚酸(PFHpA)分別為0～1.25、0.21～1.15、0～1.37、0～0.44、0.15～0.42 ng/g[8]。且與長(zhǎng)鏈PFASs相比，短鏈PFASs在植物體內(nèi)具有更高的富集和遷移能力[9]。然而，短鏈全氟羧酸(PFCAs)對(duì)植物的生態(tài)毒理效應(yīng)目前尚未明確。

小麥作為全球最主要的糧食作物之一，常被用來(lái)研究化學(xué)品生態(tài)毒性效應(yīng)[10]。本研究以小麥為模式生物，為避免土壤中微生物等諸多可能影響PFCAs性質(zhì)的因素，選用水培方式，探究5種短鏈PFCAs(PFPrA、PFBA、PFPeA、PFHxA和PFHpA)對(duì)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

甲醇(色譜純)；PFPrA、PFPeA(純度97%)；PFBA、PFHpA和PFHxA(純度98%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選籽粒飽滿、無(wú)蟲(chóng)害的小麥種子，在3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O2中表面滅菌5 min，再用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鈣浸泡2 h，去離子水淋洗2～3次，待用。

分別配制5種短鏈PFCAs的甲醇儲(chǔ)備液，加入Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)置PFCAs質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L[11]216，設(shè)置6個(gè)平行(3個(gè)平行用于發(fā)芽測(cè)定，3個(gè)平行用于生長(zhǎng)指標(biāo)、葉綠素和酶活性測(cè)定)，并設(shè)置空白對(duì)照。在每個(gè)培養(yǎng)皿(9 cm)中加15粒種子，10 mL相應(yīng)溶液，保證溶液浸透濾紙并完全浸潤(rùn)小麥種子，每天定期添加去離子水，放置于恒溫光照培養(yǎng)箱中(25.0±0.5) ℃黑暗條件下培養(yǎng)，待發(fā)芽階段結(jié)束后，培養(yǎng)條件改變?yōu)?25.0±0.5) ℃白天光照14 h，(22.0±0.5) ℃夜間黑暗10 h，定期更換培養(yǎng)皿的位置以保證光照均勻。

1.3 測(cè)量指標(biāo)和方法

小麥種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率分別在第3、7天測(cè)定[12]。第14天收集小麥，測(cè)定小麥的生物量。采用直尺測(cè)定根長(zhǎng)及株高。利用朗伯-比爾定律[13]1086測(cè)定葉綠素a和葉綠素b含量。

取小麥根組織0.5 g于研磨器中，加入2 mL磷酸緩沖液，4 ℃下進(jìn)行冰浴研磨，勻漿，離心，取上清液置于-80 ℃下保存待測(cè)。根據(jù)超氧化物歧化酶(SOD)能抑制氮藍(lán)四唑還原的原理[14]測(cè)定SOD活性。利用過(guò)氧化物酶(POD)酶促H2O2氧化愈創(chuàng)木酚原理，在470 nm處測(cè)定吸光度的方法測(cè)定POD活性；通過(guò)催化分解H2O2，在240 nm處測(cè)定吸光度的方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性[15]。依據(jù)硫代巴比妥酸法[13]1087測(cè)定丙二醛(MDA)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)描述性分析采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Tukey法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 短鏈PFCAs對(duì)小麥種子萌發(fā)的影響

短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的影響見(jiàn)圖1。相對(duì)于空白對(duì)照，5種短鏈PFCAs對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)影響較小，但0.1、0.5 mg/L短鏈PFCAs對(duì)小麥種子發(fā)芽率總體具有促進(jìn)作用。研究認(rèn)為，由于PFCAs具有良好的表面活性，能改變細(xì)胞膜通透性，影響植物細(xì)胞代謝[16]557。較低PFCAs可導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生興奮效應(yīng)，在一定程度上刺激小麥種子的萌發(fā)。同時(shí)，小麥萌發(fā)早期，發(fā)芽所需的能量供應(yīng)主要來(lái)源于胚內(nèi)物質(zhì)，只有當(dāng)暴露濃度達(dá)到閾值時(shí)，PFCAs毒性能抑制小麥種子發(fā)芽[17]。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0、5.0 mg/L時(shí)，短鏈PFCAs能抑制小麥種子發(fā)芽率，且在5.0 mg/L時(shí)抑制率為6.75%～39.19%。在PFHxA(2.0、5.0 mg/L)和PFHpA(5.0mg/L)處理組中，PFCAs對(duì)發(fā)芽率抑制顯著，這可能是由于隨著碳鏈長(zhǎng)度的增長(zhǎng)，PFCAs毒性作用也會(huì)逐漸增強(qiáng)?？傮w上，短鏈PFCAs對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率影響不顯著，短鏈PFCAs對(duì)小麥種子萌發(fā)影響較小。

注：*表示處理組與空白對(duì)照之間的差異顯著(P<0.05)，圖2至圖5同。圖1 短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of short-chain PFCAs mass concentrations on seed germination potential and germination rate of wheat

2.2 短鏈PFCAs對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥幼苗根長(zhǎng)、株高、生物量的影響見(jiàn)圖2。與空白對(duì)照相比，1.0 mg/L短鏈PFCAs均能誘導(dǎo)小麥根長(zhǎng)顯著增加16.62%～50.35%；在PFPrA(1.0 mg/L)、PFBA(1.0 mg/L)和PFHxA(0.5 mg/L)處理組中，小麥株高顯著增加27.45%～47.14%；在PFBA(0.5、1.0 mg/L)、PFPeA(0.5 mg/L)和PFHpA(0.5、1.0 mg/L)處理組中，小麥幼苗生物量顯著增加10.84%～27.84%。小麥幼苗根長(zhǎng)、株高及生物量對(duì)短鏈PFCAs的響應(yīng)呈現(xiàn)先升后降的Hormesis趨勢(shì)[18]?？赡茉蚴牵?1)低濃度短鏈PFCAs能導(dǎo)致小麥植物細(xì)胞產(chǎn)生興奮效應(yīng)，刺激小麥幼苗的生長(zhǎng)。(2)表面活性劑能誘導(dǎo)植物細(xì)胞膜通透性增加[19]，因PFCAs具有良好的表面活性，可對(duì)小麥吸收營(yíng)養(yǎng)成分具有一定促進(jìn)作用。這與LAN等[20]30910研究PFBA和PFHxA對(duì)小麥植株生態(tài)毒理效應(yīng)影響結(jié)果相似，即在低暴露質(zhì)量濃度(<0.20 mg/kg)條件下，PFBA和PFHxA能誘導(dǎo)小麥幼苗的生物量增加。研究發(fā)現(xiàn)，PFOA在高暴露質(zhì)量濃度(>0.20 mg/kg)條件下，能引起小麥幼苗的根和莖葉的細(xì)胞損傷，抑制小麥生長(zhǎng)[21]。在相同處理?xiàng)l件下，相對(duì)于株高，小麥根長(zhǎng)受影響更大。有研究指出，有機(jī)污染物的生態(tài)毒性效應(yīng)不僅與暴露濃度有關(guān)，還與直接作用的植物化學(xué)特性及毒性機(jī)制有關(guān)[22]。本實(shí)驗(yàn)中，小麥幼苗的根直接暴露于含PFCAs的營(yíng)養(yǎng)液中，因此小麥根對(duì)污染物毒性的響應(yīng)更直接、敏感[23]。

圖2 短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥幼苗根長(zhǎng)、株高、生物量的影響Fig.2 Effects of short-chain PFCAs mass concentrations on the root length，plant height and biomass of wheat

2.3 短鏈PFCAs對(duì)小麥幼苗葉綠素的影響

植物體內(nèi)葉綠素是衡量植物體氧化損傷和生長(zhǎng)抑制的重要指標(biāo)。短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥幼苗葉綠素的影響見(jiàn)圖3。受短鏈PFCAs影響，小麥幼苗葉綠素均比空白對(duì)照低，表明PFCAs對(duì)小麥具有生態(tài)毒理效應(yīng)。其中，0.5～2.0 mg/L PFPrA能顯著抑制葉綠素，抑制率為23.65%～27.52%。QIAN等[11]218研究PFOS對(duì)蘆葦(Phragmitescommunis)的毒理效應(yīng)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨PFOS暴露濃度的升高，蘆葦植株內(nèi)葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本研究結(jié)果與此相似，即暴露于PFCAs條件下，小麥莖葉內(nèi)葉綠素合成會(huì)受到抑制。這可能是由于PFCAs毒性作用，小麥莖葉內(nèi)光吸收復(fù)合物的合成受到抑制[20]30911；PFCAs可能會(huì)作用于葉綠體的電子傳輸過(guò)程，導(dǎo)致葉綠素下降[24]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，相同暴露濃度條件下，相比于PFHpA，PFPrA對(duì)小麥莖葉內(nèi)葉綠素抑制更強(qiáng)，可能由于鏈長(zhǎng)較短的PFCAs在植物莖葉具有更高的遷移、富集能力[25]，對(duì)葉綠素合成的抑制作用更明顯。

圖3 短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥幼苗葉綠素的影響Fig.3 Effects of short-chain PFCAs mass concentrations on the chlorophyll of wheat

2.4 短鏈PFCAs對(duì)小麥根抗氧化酶活性的影響

植物體內(nèi)的抗氧化酶水平可靈敏反映植物受到污染后的響應(yīng)程度[26]。短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥根抗氧化酶活性的影響見(jiàn)圖4。小麥根SOD和POD活性均顯著高于空白對(duì)照，且變化趨勢(shì)相似。當(dāng)PFCAs為1.0、2.0 mg/L時(shí)，CAT活性顯著增大至峰值，增加率為66.40%～111.55%。小麥根中抗氧化酶活性對(duì)短鏈PFCAs的響應(yīng)表現(xiàn)出先升后降的“倒U”型趨勢(shì)。QU等[16]558通過(guò)研究PFOS對(duì)小麥生態(tài)毒理效應(yīng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度(0.1～10.0 mg/L)PFOS能誘導(dǎo)小麥植株SOD和POD活性增強(qiáng)，高濃度則能抑制抗氧化酶活性。本研究結(jié)果與上述現(xiàn)象類似，當(dāng)植物受到外源有機(jī)污染物脅迫時(shí)，通常會(huì)產(chǎn)生較多活性氧(ROS)，主要包括H2O2、羥基自由基和超氧陰離子。SOD可將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，然后POD和CAT能經(jīng)過(guò)催化氧化消除H2O2[27]。較低濃度PFCAs時(shí),短鏈PFCAs影響小麥根細(xì)胞通透性，進(jìn)而影響小麥根細(xì)胞代謝活動(dòng)，刺激抗氧化酶活性增強(qiáng)[16]557。高濃度PFCAs脅迫時(shí)，ROS累積過(guò)多，細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，抗氧化酶活力下降[28]。

圖4 短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥根抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of short-chain PFCAs mass concentrations on antioxidant enzymes activities in root

2.5 短鏈PFCAs對(duì)小麥根MDA的影響

短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥根MDA的影響見(jiàn)圖5。0.5、1.0 mg/L的PFCAs對(duì)小麥根MDA抑制作用總體最大，抑制率為4.72%～26.38%，且小麥根MDA在5.0 mg/L的PFCAs時(shí)達(dá)到峰值。小麥根MDA對(duì)短鏈PFCAs的響應(yīng)呈現(xiàn)“U”型趨勢(shì)。有研究指出，脂質(zhì)過(guò)氧化常作為植物受脅迫時(shí)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物[29]。而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可間接表明ROS水平[30]。低暴露濃度短鏈PFCAs能抑制小麥根MDA，可說(shuō)明此時(shí)ROS含量較低，細(xì)胞氧化損傷較小。MDA下降原因可能是低濃度PFCAs能刺激抗氧化酶活性增強(qiáng)，ROS能及時(shí)被清除，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[31]。但當(dāng)PFCAs暴露濃度較高時(shí)，小麥根細(xì)胞中MDA逐漸增加，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加劇，細(xì)胞受到氧化損傷。

圖5 短鏈PFCAs質(zhì)量濃度對(duì)小麥根MDA的影響Fig.5 Effects of short-chain PFCAs mass concentrations on MDA in root

3 結(jié) 論

(1) 短鏈PFCAs對(duì)小麥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率影響總體不顯著，短鏈PFCAs對(duì)小麥種子萌發(fā)影響較小。

(2) 小麥幼苗根長(zhǎng)、株高及生物量對(duì)短鏈PFCAs的響應(yīng)呈現(xiàn)先升后降的Hormesis趨勢(shì)。

(3) 受短鏈PFCAs影響，小麥幼苗葉綠素均比空白對(duì)照低，表明PFCAs對(duì)小麥具有生態(tài)毒理效應(yīng)。

(4) 小麥根SOD和POD活性均顯著高于空白對(duì)照，且變化趨勢(shì)相似。當(dāng)PFCAs為1.0、2.0 mg/L時(shí)，CAT活性顯著增大至峰值，增加率為66.40%～111.55%。

(5) 小麥根MDA對(duì)短鏈PFCAs的響應(yīng)呈現(xiàn)“U”型趨勢(shì)，高濃度PFCAs能導(dǎo)致小麥根脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加劇。