雞毛在低共熔體系中的溶解再生及其多孔復(fù)合材料制備

劉子同，袁久剛，薛 琪，范雪榮，高衛(wèi)東

(生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫 214122)

低共熔體系的物理化學(xué)性質(zhì)與傳統(tǒng)的低溫熔融鹽相似，因此又被稱作“類離子液體”[1]。其通常由膽堿鹽和配位劑(如金屬鹽、金屬鹽水合物或氫鍵供體等)組合而成，但與傳統(tǒng)的低溫熔融鹽相比，低共熔體系還具有原料來源廣泛、不揮發(fā)、無毒、可降解、價格低廉以及容易制備等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。

近年來，低共熔體系在天然高分子溶解方面獲得了研究者的廣泛關(guān)注，尤其是在木質(zhì)素溶解方面。例如：Tehunen等[4]和Chen等[5]利用氯化膽堿-乳酸低共熔體系對木質(zhì)素進(jìn)行溶解，實(shí)現(xiàn)了木質(zhì)素和纖維素的有效分離；Marino等[6]研究了木質(zhì)素在尿素-氯化膽堿低共熔體系中的解聚；Biswas等[7]發(fā)現(xiàn)淀粉也可以溶于草酸-氯化膽堿低共熔體系中。郭振[8]用幾種離子液體和低共熔體系實(shí)現(xiàn)了糖類化合物的溶解，具有一定成效。蒲磊等[9]用尿素-氯化膽堿低共熔體系溶解纖維素，分析纖維素與該體系的作用方式，證明了該體系能夠有效溶解纖維素。這些研究都表明在天然高分子的溶解和再生方面，低共熔體系具有較大的應(yīng)用前景。

姜哲等[10-11]研究了天然角蛋白在尿素-氯化膽堿低共熔體系中的溶解及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)尿素-氯化膽堿體系可以對角蛋白纖維進(jìn)行溶解，但由于缺乏還原性，不能有效打開羊毛中的二硫鍵，導(dǎo)致溶解效率不高。本文在其研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了一種新型的還原型低共熔體系——巰基乙酸膽堿，該體系具有優(yōu)良的二硫鍵破壞能力，可用于雞毛等廢棄羽毛的溶解再生，本文研究了該體系對雞毛角蛋白的溶解機(jī)制及再生角蛋白的特征，制備了多孔復(fù)合材料。對雞毛等廢棄毛發(fā)資源的有效利用具有較好的啟示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

雞毛，家禽市場自行收集；巰基乙酸膽堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%，上海成捷離子液體有限公司。

XPV600E 電腦型偏光顯微鏡(上海比目儀器有限公司)；NICOLET is10傅里葉變換光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；D8 X射線衍射儀(德國 Bruker 公司)；Mini-protean Tetro Cells 電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 脫脂處理

將雞毛洗凈自然晾干后，利用粉碎機(jī)進(jìn)行初步粉碎，過篩之后稱取適量粉碎雞毛粉置于索氏提取器中，用丙酮抽提脫脂48 h，60 ℃烘干后備用。

1.3 再生角蛋白提取

稱取1 g脫脂雞毛粉，將其置于20 g巰基乙酸膽堿中，于120 ℃磁力加熱攪拌溶解一定時間，得到黃色混合液，然后向混合液加入適量8 mol/L尿素溶液，靜置15 min，采用砂芯漏斗過濾，濾液用透析袋(截留相對分子質(zhì)量8 000～12 000 Da)透析3天，將可溶性蛋白溶液冷凍干燥，得到再生角蛋白。

1.4 溶解過程觀察

將單根雞毛纖維置于盛有巰基乙酸膽堿的特制載玻片凹槽中，利用熱臺加熱，用數(shù)碼偏光顯微鏡觀察其溶解過程，拍照記錄。

1.5 紅外光譜(FTIR)測試

采用KBr壓片法分別測試雞毛粉和再生雞毛角蛋白粉的紅外反射光譜。測試條件：掃描范圍 4 000～600 cm-1，分辨率0.4 cm-1，掃描32次。

1.6 X射線衍射(XRD)測試

采用D8 X射線衍射儀分別對雞毛粉和再生角蛋白進(jìn)行測試，測試條件：Cu靶，工作電壓30 kV，工作電流10 mA，掃描范圍5°～50°，步長0.02 (°)/min。

1.7 凝膠電泳(SDS-PAGE)測試

采用Mini-protean Tetro Cells 電泳系統(tǒng)對雞毛和再生角蛋白分別進(jìn)行測試，測試使用的SDS-PAGE凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，標(biāo)準(zhǔn)蛋白指示劑為10～270 kDa。

1.8 多孔材料制備

將角蛋白溶液用聚乙二醇(相對分子質(zhì)量20 000)濃縮至 60 g/L后，加入一定比例的PEG 400(聚乙二醇，相對分子質(zhì)量400)，在37 ℃下將其混勻，之后將溶液倒入24孔板中，靜置脫泡并冷卻至室溫后，-20 ℃ 冷凍8 h，-40 ℃ 冷凍干燥36 h，即可得到角蛋白多孔復(fù)合材料。

1.9 毒理性能測試

按照ISO 10993-5—2009《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分:細(xì)胞毒性體外試驗(yàn)》，采用直接接觸的方法測試毒理性。取100 μL的 NIH/3T3細(xì)胞(小鼠胚胎細(xì)胞)懸浮液注入細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，最后加10 μL細(xì)胞計數(shù)試劑CCK-8到各孔板中反應(yīng)1 h，用酶標(biāo)儀記錄450 nm處吸光度，每種樣品重復(fù)測試3次，計算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=A1/A0×100%

式中：A1和A0分別為樣品和空白樣的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞毛溶解過程偏光觀察

雞毛在巰基乙酸膽堿中的溶解過程見圖1。

圖1 雞毛在巰基乙酸膽堿中的溶解過程(120 ℃)

從圖1可以看出，雞毛在巰基乙酸膽堿體系中可以發(fā)生快速溶解，13 min左右即可以完全溶解消失(圖1(f))。溶解時，首先發(fā)生羽小枝的溶解，之后羽枝和羽軸逐漸溶解變細(xì)(圖1(b)～(d))，隨著溶解時間繼續(xù)延長，羽枝進(jìn)一步變細(xì)，而羽軸也逐漸斷裂(圖1(e))。在此過程中，羽軸中的二硫鍵被巰基乙酸膽堿還原為硫化氫氣體(硫化鉛試紙檢測時變黑)，導(dǎo)致視野中產(chǎn)生較多小氣泡(圖1(d)～(e))。綜合來看，雞毛角蛋白中的構(gòu)象以β折疊為主，相對于羊毛等α-角蛋白纖維，其含硫量較低。巰基乙酸膽堿低共熔體系不僅具有較強(qiáng)的氫鍵拆散作用，而且具有對二硫鍵的還原能力，在其雙重作用下，雞毛角蛋白可以發(fā)生快速溶解。

2.2 再生角蛋白的結(jié)構(gòu)性能表征

2.2.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

雞毛及其再生角蛋白的紅外光譜圖見圖2。

圖2 雞毛及其再生角蛋白的紅外光譜圖

由圖2可以看出，雞毛和再生角蛋白都含有角蛋白的特殊吸收峰，在酰胺A帶(3 300～3 290 cm-1)、酰胺I帶(1 650 cm-1)、酰胺Ⅱ帶(1 540～1 530 cm-1)以及酰胺Ⅲ帶(1 243～1 237 cm-1)均有明顯的酰胺鍵吸收[12]，這說明溶解再生的雞毛角蛋白保留了完好的蛋白結(jié)構(gòu)。相對原雞毛，再生角蛋白在1 070 cm-1和958 cm-1附近出現(xiàn)了一些新的特征峰，這是胱氨酸一氧化物所引起的伸縮振動吸收峰[13-14]，該吸收峰在原雞毛角蛋白中基本不存在，初步判斷這是由于雞毛角蛋白在巰基乙酸膽堿溶解過程中，其所含的部分二硫鍵被還原為巰基，在高溫條件下又被空氣氧化為胱氨酸所致。

2.2.2 晶體結(jié)構(gòu)分析

為了研究結(jié)晶度變化，對其進(jìn)行X射線衍射分析，雞毛及其再生角蛋白X射線衍射圖譜見圖3。

圖3 雞毛及其再生角蛋白X射線衍射圖譜

從圖3可以看出，雞毛及再生角蛋白在9°及20°附近都存在明顯的晶體衍射峰[15]。與原雞毛相比，再生角蛋白在20°附近特征峰強(qiáng)度略有下降，但是9°附近特征峰強(qiáng)度有所下降，說明雞毛在巰基乙酸膽堿溶解再生過程中，二級結(jié)構(gòu)被破壞，再生角蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊都降低，但是無規(guī)結(jié)構(gòu)增加。

2.2.3 分子量分析

雞毛及其再生角蛋白電泳分析見圖4。

圖4 雞毛及其再生角蛋白電泳分析

從圖4可以看出，原雞毛角蛋白(圖4(b))泳道在35 kDa 以下，在40～170 kDa范圍內(nèi)顏色較淺，但也存在一定分子量分布。經(jīng)巰基乙酸膽堿再生后的角蛋白(圖4(a))，其高分子量區(qū)域(20～170 kDa范圍)顏色進(jìn)一步變淺，近乎無色，而低分子量區(qū)域(<20 KDa)顏色進(jìn)一步升高。說明角蛋白在溶解再生過程中由于二硫鍵等價鍵的斷裂，大部分降解為小分子蛋白。

2.2.4 雞毛和再生角蛋白的氨基酸分析

雞毛及其再生角蛋白的氨基酸分析見圖5。

Asp—天冬氨酸；Glu—谷氨酸；Ser—絲氨酸；His—組氨酸；Gly—甘氨酸；Thr—蘇氨酸；Arg—精氨酸；Ala—丙氨酸；Tyr—酪氨酸；Cys—半胱氨酸；Val—纈氨酸；Met—甲硫氨酸；Phe—苯丙氨酸；Ile—異亮氨酸；Leu—亮氨酸；Lys—賴 氨酸；Pro—脯氨酸。

由圖5可以看出，雞毛經(jīng)巰基乙酸膽堿溶解再生后，其再生角蛋白中各氨基酸組成與原雞毛組成相似，但是氨基酸相對含量大部分均有所降低。這是由于溶解再生時，在溶液中會產(chǎn)生部分氨基酸流失；其中，半胱氨酸含量降低50%以上，最為明顯，可能是在雞毛溶解過程中，由于巰基乙酸膽堿的強(qiáng)烈還原作用，使得羽軸和羽枝中存在的大量二硫鍵被還原，一部分轉(zhuǎn)化成為硫化氫氣體，而另一部分則轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘碾装彼嵫趸?，最終導(dǎo)致含硫氨基酸的大幅度降低。

2.3 角蛋白多孔材料

再生角蛋白多孔材料形貌見圖6。

圖6 再生角蛋白多孔材料形貌

從圖6(a)可以看出，角蛋白/PEG混合材料能夠通過凍干法形成均勻的多孔材料，結(jié)構(gòu)較為疏松，具有像海綿一樣的彈性。由圖6(b)可以看出，再生雞毛角蛋白截面呈疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小介于10～100 μm之間，比較均勻，這對于細(xì)胞在組織材料上的生長和擴(kuò)散具有重要意義。對其生物細(xì)胞毒理性測試結(jié)果表明，再生角蛋白評級為：對細(xì)胞無毒，其增殖率 >100%，說明角蛋白具有較好的生物相容性。

3 結(jié) 論

巰基乙酸膽堿還原型低共熔體系，具有優(yōu)良的二硫鍵破壞能力以及氫鍵拆散能力，在廢棄羽毛等天然角蛋白資源的溶解再利用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

①采用巰基乙酸膽堿低共熔體系可以高效溶解雞毛，制備雞毛再生角蛋白。在溶解過程中，角蛋白主體結(jié)構(gòu)并沒有完全破壞，但是其結(jié)晶度和分子量都有一定程度降低，氨基酸組成也發(fā)生了變化，尤其是含硫氨基酸大幅度下降，說明巰基乙酸膽堿低共熔體系能夠有效破壞二硫鍵，因此能夠高效溶解雞毛。

②利用再生雞毛角蛋白和PEG混合可以制備角蛋白多孔材料，該材料對細(xì)胞無毒，在醫(yī)用材料方面具有廣泛的應(yīng)用。