侵襲性感染嬰兒的B群鏈球菌血清學分布及相關(guān)耐藥基因研究

杜琴，吳猛賢，施橋發(fā)，余曉君，劉發(fā)娣，柯江維

（1.江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2.江西省中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；3.南昌大學基礎(chǔ)學院，江西 南昌 330006）

B群鏈球菌（group B streptococcus,GBS），又稱為無乳鏈球菌（S.agalactiae），是一種定植在人類下消化道及泌尿生殖道的細菌，健康人群帶菌率為15%～35%，是導致圍產(chǎn)期母親及新生兒嚴重感染的重要致病菌之一[1-2]。根據(jù)嬰兒GBS發(fā)病時間分為早發(fā)型（GBS-EOD）和晚 發(fā)型（GBS-LOD）。EOD是指感染發(fā)生在出生后6 d內(nèi)，晚發(fā)型為7 d至3個月內(nèi)，GBS侵襲性感染可引起新生兒或嬰兒肺炎、膿毒血癥、腦膜炎等，具有致殘率和病死率較高的特點[3]，歐美等發(fā)達國家對GBS感染相關(guān)疾病負擔非常重視。我國大部分研究局限于孕產(chǎn)婦定植菌株的研究，嬰兒GBS侵襲性感染數(shù)據(jù)仍較缺乏。為了解本地區(qū)嬰兒GBS侵襲性感染菌株血清學分布特點及耐藥基因攜帶情況，特展開此研究。

1 資料和方法

1.1 研究對象 收集江西省兒童醫(yī)院患兒無菌部位分離獲得的GBS菌株62株，納入標準為⑴發(fā)病年齡為0～1歲的嬰兒；⑵侵襲性GBS感染即無菌體液或組織分離培養(yǎng)GBS陽性的病例；⑶診斷為血流感染及化膿性腦膜炎的患兒。剔除同一患兒不同時間段或不同標本類型分離的相同生物學特征和相同藥敏試驗結(jié)果的GBS菌株。

1.2 細菌培養(yǎng)、鑒定與藥敏 患兒的血液、腦脊液等無菌體液標本接種于BD兒童血培養(yǎng)瓶后放置血培養(yǎng)儀進行培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶報陽后轉(zhuǎn)種至血平板，35℃、5%CO2培養(yǎng)18～24 h，通過細菌形態(tài)學觀察，phoneix-100全自動細菌分析系統(tǒng)對細菌進行鑒定及抗菌藥物最低抑菌濃度檢測（MIC），藥敏結(jié)果參考美國臨床和實驗室協(xié)會指南（CLSI-100）2021年標準進行判讀。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC25923）。

1.3 誘導型克林霉素耐藥試驗 （D試驗） 按照2021版CLSI-100采用雙紙片法對紅霉素耐藥、克林霉素敏感的GBS菌株進行耐藥表型檢測。細菌對紅霉素和克林霉素均耐藥，即為結(jié)構(gòu)性耐藥表型（cMLSB）；若紅霉素耐藥，靠近紅霉素處克林霉素抑菌圈出現(xiàn)減少或截平，報告D試驗陽性，結(jié)果為紅霉素誘導克林霉素耐藥表型（iMLSB）；若對紅霉素耐藥而克林霉素抑菌圈無減少或截平，即M表型。若克林霉素耐藥而紅霉素敏感，即為L型。

1.4 細菌DNA提取和PCR擴增 采用煮沸法提取細菌DNA。普通PCR方法檢測紅霉素耐藥基因ermA、ermB、mefA/E；克林霉素耐藥基因linB；四環(huán)素耐藥基因tetO、tetM、tetL、tetK及莢膜血清型cps基因，引物參考文獻[4-6]設(shè)計。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠180 V電泳30 min后，Gel DOC凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行分析，兩組間的比較采用χ2檢驗或fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GBS莢膜血清型分布62例GBS感染病例中早發(fā)型29例，晚發(fā)型33例。其中單純血培養(yǎng)陽性40例，腦脊液培養(yǎng)陽性9例，血和腦脊液同時檢出GBS菌株13例。62株GBS共檢出Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ、Ⅴ4種莢膜血清型，其中Ⅲ型32株（51.6%）為最常見血清型，其余依次為Ⅰb型21株（33.6%），Ⅰa型8株（12.9），Ⅴ型1株（1.6%）。GBS-EOD血清型分布依次為Ⅲ型13株（44.8%）、Ⅰb型12株（41.4%）、Ⅰa型3株（10.3%）、Ⅴ型1株(3.4%)；GBS-LOD血清型分布依次為Ⅲ型19株（57.6%）、Ⅰb型9株（27.3%）、Ⅰa型5株（15.2%）、早發(fā)型和晚發(fā)型血清型分布無顯著差異。22株腦脊液GBS菌株中Ⅲ型14株（63.6%）、Ⅰb型7株（31.8%）、Ⅰa型1株（4.5%）。

2.2 藥敏試驗及耐藥基因檢測結(jié)果 62株GBS菌株對青霉素、頭孢噻肟、利奈唑胺、萬古霉素均敏感；對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星耐藥率為83.9%、80.6%、69.4%、17.7%。各血清型耐藥率，見表1。52株紅霉素耐藥菌株中cMLSB 49株；M型3株，未檢出iMLSB型;L耐藥表型檢出2株。紅霉素耐藥基因ermB檢出率最高約86.5%（45/52），44.2%菌株檢出mefA/E，ermB與mefA/E可單獨存在也可并存，3株M表型菌株均單獨攜帶mefA/E基因；未檢出ermA基因,linB基因檢出率32.0%。四環(huán)素耐藥基因以tetO和tetM為主，未檢出tetL和tetK。血清型與耐藥表型基因檢出類型具體，見表2。

表1 62株GBS耐藥性與血清分型相關(guān)性

表2 GBS不同血清型與紅霉素、四環(huán)素耐藥基因分布

3 討論

1970年GBS被發(fā)現(xiàn)可引起新生兒早發(fā)型感染，后期研究表明EOD最常見的發(fā)病機制是母體胃腸道和泌尿生殖道中存在的GBS在子宮腔的上升定植，感染發(fā)生于隨后的胎兒定植和或胎兒吸入感染的羊水[7]。這種發(fā)病機制主要發(fā)生在足月兒分娩期間，早產(chǎn)兒感染的時機不大確定，可能是胎膜早破和或早產(chǎn)過程中發(fā)生[8]。GBS陽性母親產(chǎn)下的新生兒大約50%存在B群鏈球菌定植，其中1%～2%將發(fā)展為GBS早發(fā)型[9]。20世紀90年代，發(fā)達國家推薦的GBS產(chǎn)前篩查及分娩期預防性使用抗菌藥物（IAP）,有效減低了新生兒GBS感染的發(fā)病率和病死率,德國研究數(shù)據(jù)[10]顯示GBS-EOD下降率大約為80%，EOD與LOD比例由80:20下降至60:40，美國GBS-EOD發(fā)病率由1.8每1000活產(chǎn)兒降至2015年0.23每1000活產(chǎn)兒，然而LOD卻無明顯下降趨勢[11]。LOD發(fā)病機制目前尚不清楚，有研究認為部分LOD發(fā)生與母體內(nèi)GBS定植和母乳喂養(yǎng)有關(guān)[12]，IAP的實施可能降低母親體內(nèi)GBS定植密度,但是并沒有影響母體定植的狀態(tài)[13],大多數(shù)陽性的產(chǎn)婦8周后仍然檢測到GBS重新定植[14]。也有學者認為LOD病例中母體并不普遍存在GBS定植，照料人的水平傳播同樣能引起嬰兒GBS感染[11]。目前普遍認為通過在妊娠早期提供疫苗保護比任何產(chǎn)時的預防更加有效，它能夠提供一個長期的更有效的免疫，即使在GBS-LOD感染也同樣有保護作用。迄今為止，作為GBS血清分型系統(tǒng)為基礎(chǔ)的含唾液酸的莢膜多糖（CPS）一直是大多數(shù)疫苗開發(fā)的重要關(guān)健點。目前覆蓋五種血清型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、V）的多價結(jié)合疫苗已經(jīng)在3期臨床試驗階段[15]。

莢膜多糖抗原是GBS主要的毒力因子之一，根據(jù)莢膜多糖成分不同，可將GBS分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ-Ⅸ，共10種血清型。RUSSELL等學者對全球已發(fā)表的相關(guān)數(shù)據(jù)進行mete分析，結(jié)果顯示孕產(chǎn)婦定植血清型存在明顯的地域差異，如Ⅲ型血清型在亞洲分布較低，而VI、VII、VIII等少見的血清型更為常見；在非洲境內(nèi)，西非比其他地區(qū)更經(jīng)常報告V型[16]。SHABAYEK調(diào)查結(jié)果顯示，美國和歐洲存在的定植菌株主要為Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ和V血清型，IV和V分別在阿拉伯和埃及占主導地位，而VI和VIII型在日本孕婦中普遍流行[17]。我國臺灣地區(qū)數(shù)據(jù)表明VI型為孕產(chǎn)婦主要定植型，而引起嬰兒侵襲性感染的菌株血清型以Ⅲ型為主，其次為Ⅰa型[18]。江西省婦幼保健院數(shù)據(jù)顯示孕產(chǎn)婦攜帶GBS血清型較多，以Ⅰb型和Ⅲ型為主，其次為Ⅰa、V、Ⅱ、IV和IX[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒侵襲性菌株共四種血清型，依次為Ⅲ型51.6%、Ⅰb型33.6%、Ⅰa型10.3%、Ⅴ型3.4%；國內(nèi)林雅茵報道廈門地區(qū)患兒血清型分布依次為Ⅲ型59.0%、Ⅰa型15.7%、Ⅰb型14.5%、Ⅱ型4.8%、Ⅴ型3.6%[20]；中國嬰兒GBS感染多中心前瞻性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型（61.5%）和Ⅰb(28.7%)為主要血清型，其次為少量的Ⅰa（15.7%）、Ⅴ（7.0%）、IV和VI各(0.4%)及1例未定型，并且各地區(qū)血清學分布較相似，北部和東北部由血清型Ⅰb引起的比例高于其他地區(qū)[21]。Madrid認為全球不同區(qū)域引起嬰兒患病的流行血清型是較相似的，僅有輕微的變化，以血清型Ⅲ為主導，Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和V型覆蓋97%的菌株[22]。嬰兒侵襲性菌株血清型可能更具有特點，與定植型GBS之間的血清學和遺傳學關(guān)聯(lián)值得進一步探討。

本研究顯示早發(fā)和晚發(fā)型均以血清型Ⅲ型最常見，占比約44.8%和57.6%。腦脊液標本GBS菌株Ⅲ型約63.6%，與中國學者Ji研究數(shù)據(jù)[21]較接近，德國和意大利數(shù)據(jù)顯示80%以上的GBS化膿性腦膜炎由Ⅲ型血清型引起，并且Ⅲ型與LOD也存在明顯相關(guān)性[23-24]。血清Ⅲ型GBS比其他血清型更能引起侵襲性疾病，Ⅲ型多糖末端唾液酸殘基的存在抑制了補體替代途徑的激活，從而抑制了對GBS的吞噬作用[25-26]。

在中國廣泛使用紅霉素和克林霉素帶來的高耐藥率給青霉素過敏的患兒臨床用藥帶來極大的挑戰(zhàn)，本研究GBS菌株對紅霉素和克林霉素耐藥率分別為83.9%和82.6%。近期關(guān)于中國孕產(chǎn)婦的研究報道GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率72.0%、66.4%[27]，低于本研究。GBS菌株對紅霉素的主要耐藥機制是由erm基因介導的核糖體靶位點甲基化修飾，從而引起細菌MLSB交叉耐藥，此外，GBS對紅霉素的耐藥機制還包括mefA/E基因介導的外排作用，導致細菌對14.15元大環(huán)內(nèi)酯耐藥。本研究顯示GBS紅霉素耐藥株最主要的表型為cMSLB,主要由ermB和（或）mefA/E基因介導，與聶署萍和何其勵等研究相符[5-6]，在伊朗和韓國,ermB和ermA/TR是大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主要基因[28-29],ermA/TR主要介導iMLSB型耐藥[12]，本次尚未檢出。mefA/E基因介導的外排泵即使在紅霉素的存在下，并不能泵出克林霉素及林可內(nèi)酰胺類藥物，本實驗中3株M型菌株均單獨攜帶mefA/E基因。血清型與耐藥表型及基因的相關(guān)性分析顯示，21株Ⅰb型均為cMLSB表型且均攜帶ermB和tetO基因；血清型Ⅰb型和Ⅲ型較Ⅰa型對紅霉素、克林霉素及四環(huán)素表現(xiàn)出較高的耐藥率，差異有統(tǒng)計學意義；全敏感菌株4株有3株為Ⅰa型。V型被報道具有獲得大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性[12]，但因檢出菌株檢出較少無法獲得比較數(shù)據(jù)。

綜上所述，引起嬰兒侵襲性感染的GBS菌株血清型分布較集中，以Ⅲ型最常見。本研究局限性在于菌株僅來源于江西省兒童醫(yī)院，樣本量較少，但研究對象為侵襲性感染患兒，血清學分布、耐藥性及基因的研究對疫苗的研發(fā)和推廣、臨床制定防治嬰兒GBS感染方案具有重要的指導價值，對預防和控制耐藥株的產(chǎn)生和傳播至關(guān)重要。