EB病毒潛伏膜蛋白2的抗原表位預(yù)測及其與HLA等位基因的相關(guān)性分析

鄒淑慧，黃薇，劉聰，鄒翠翠，廖莎莎，張麗琴

（1.贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 贛州 341000；2.贛州市章貢區(qū)東外社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，江西 贛州 341000）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種人類皰疹病毒，與Burkitt’s淋巴瘤、胃癌以及鼻咽癌等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。有報道[2-3]稱在鼻咽癌等惡性腫瘤組織中EBV能持續(xù)表達(dá)EBNA1、LMP1、LMP2等蛋白，可作為體內(nèi)特異性CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的靶分子。其中LMP2蛋白比較保守，含有HLA限制性CTL表位，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的T細(xì)胞反應(yīng)，并且不具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用。因此，LMP2是研究抗EBV腫瘤疫苗的理想靶抗原。本研究將利用生物信息軟件和網(wǎng)絡(luò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫分析不同地理株系的EB病毒LMP2氨基酸序列的同源性，預(yù)測與之相關(guān)的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，為EB病毒疫苗的設(shè)計和制備奠定基礎(chǔ)。

HLA是人類主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）基因編碼的產(chǎn)物，為人類主要的遺傳標(biāo)志。種族的和地區(qū)差異可導(dǎo)致其分布的不一致，因此具有高度多態(tài)性，而這多態(tài)性的差異決定了HLA在個體免疫中的應(yīng)答能力以及對疾病的易感性都有所不同。此外，研究發(fā)現(xiàn)HLA分子可通過與外源性抗原結(jié)合，進(jìn)而誘發(fā)CD4+T輔助細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并在免疫識別及清除病毒感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[4]。本研究將預(yù)測與EB病毒LMP2蛋白結(jié)合力較強(qiáng)的HLA等位基因，并通過數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)驗(yàn)證推導(dǎo)出EB病毒的易感人群和可能發(fā)生流行的地區(qū)，為采取積極有效的防控措施提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 EBV LMP2氨基酸序列的同源性比較 從GenBank中獲得來自不同國家地區(qū)的EBV LMP2氨基酸序列，用Clustal X和Bioedit軟件對序列進(jìn)行比對，計算氨基酸同源性。

1.2 EBVLMP2蛋白的抗原表位預(yù)測 選取中國廣東分離的LMP2蛋白序列（登陸號：ASU89583.1）為研究對象，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件及相關(guān)網(wǎng)站，分析LMP2的表位類型。所用生物信息學(xué)軟件有DNAStar程序包的Protean軟件；生物信息網(wǎng)站有：細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）表位預(yù)測網(wǎng)站：http://crdd.osdd.net/raghava/nhlapred/；輔助T細(xì)胞（Th）抗原表位預(yù)測網(wǎng)站：http://crdd.osdd.net/raghava/propred/。

1.3 EB病毒與HLA等位基因的相關(guān)性分析及易感人群的預(yù)測 利用NetMHC和NetMHCII在線軟件分析LMP2蛋白的滑動九肽與HLA分子的結(jié)合情況，篩選出與LMP2蛋白親和力較高的HLA分子等位基因，而攜帶這些等位基因的人群可能是對EB病毒敏感的人群。并通過等位基因頻率數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)查詢這些相關(guān)性較高的HLA等位基因在不同地域人群中的基因頻率，推測出可能發(fā)生EB病毒流行的地區(qū)。

2 結(jié)果

2.1 EBV LMP2氨基酸同源性分析 通過比較EBV不同地理株系的LMP2蛋白氨基酸的同源性，結(jié)果顯示該蛋白氨基酸序列相對保守，同源性在96.1%～100%，見表1，說明LMP2的抗原性可能無明顯變化，這對疫苗的研制十分重要。我們選取中國廣東分離的LMP2蛋白序列 （登陸號：ASU89583.1）為研究對象，進(jìn)行下一步的細(xì)胞抗原性表位預(yù)測。

表1 EBV LMP2氨基酸的同源性比較

2.2 EBV LMP2蛋白的B細(xì)胞抗原表位 通過DNAStar程序包的Protean模塊對EBV LMP2蛋白進(jìn)行多參數(shù)預(yù)測，包括蛋白的親水性、表面可及性、柔韌性以及抗原指數(shù)，見圖1。根據(jù)LMP2蛋白單參數(shù)的預(yù)測結(jié)果，同時結(jié)合二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測進(jìn)行綜合分析，選擇同時含有3種或3種以上參數(shù)預(yù)測的表位肽段，發(fā)現(xiàn)LMP2蛋白的10-82、90-109、173-179、199-205、235-241、289-294、379-383、413-421、484-494區(qū)段可能存在優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位，見表2。

表2 不同方案預(yù)測EBV LMP2蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

圖1 EBV LMP2蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測

2.3 EBV LMP2蛋白的T細(xì)胞抗原表位

2.3.1 CTL細(xì)胞表位預(yù)測CTL抗原表位采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法[5]進(jìn)行預(yù)測，結(jié)合多肽選擇HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*02 03及HLA-A*0205五種不同類型，閾值為0.5，見表3。綜合選擇共有的肽段，獲得EBV LMP2蛋白的優(yōu)勢CTL細(xì)胞表位區(qū)段為119-127的SMNPVCLPV以及311-319的LASLILGTL。

表3 EBV LMP2蛋白CTL抗原表位預(yù)測

2.3.2 Th細(xì)胞表位預(yù)測 使用在線程序預(yù)測Th抗原表位[6],主要分析DRB1-0101、DRB1-0102及DR B1-0301三種分子結(jié)合肽，見表4所示。綜合選擇共有的肽段，獲得EBV LMP2蛋白的優(yōu)勢Th細(xì)胞表位區(qū)段為224-232的LVMLVLLIL以及333-341的VVLLICSSC。

表4 EBV LMP2蛋白Th抗原表位預(yù)測

2.4 EB病毒與HLA等位基因的相關(guān)性分析及易感人群的預(yù)測 根據(jù)NetMHC和NetMHCII在線軟件分析LMP2蛋白的滑動九肽與HLA分子的結(jié)合情況，篩選出與LMP2蛋白的滑動九肽親和力較高的HLA分子等位基因，其中HLA-A*0201等位基因與LMP2蛋白具有高結(jié)合力，見表5。攜帶HLAA*0201等位基因的人群可能對EB病毒產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答而成為易感人群。

表5 EBV LMP2蛋白的滑動九肽與HLA等位基因的結(jié)合情況分析

通過對HLA等位基因頻率數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)的查驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)HLA-A*0201在山西漢族人群中基因頻率較高，為22.7%[7]，其次是北京漢族人群，基因頻率為15.8%[8]，在石家莊、天津漢族人群基因頻率為15.8%[9]，在江蘇漢族人群基因頻率為13.0%[10]，在廣州漢族人群基因頻率為12.8%[11]，提示EB病毒更有可能在這些地區(qū)的發(fā)生流行。

2 討論

EB病毒與多種淋巴和上皮源性腫瘤密切相關(guān)，人群中的感染率較高，約有90%以上的人群曾感染EBV[12]。疫苗的研制和應(yīng)用是目前防治EB病毒感染最有效的手段，由于表位疫苗可人為設(shè)計、易于制備，增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的同時又能減少無關(guān)反應(yīng)，因此已成為疫苗研究的趨勢和熱點(diǎn)[13]。隨著生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)展的日趨成熟，生物信息學(xué)軟件的應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)表位的預(yù)測和設(shè)計，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的針對性，大幅度減少實(shí)驗(yàn)工作量，加快研究進(jìn)展。

EBV LMP2蛋白可維持病毒處于潛伏感染狀態(tài)，并參與調(diào)控細(xì)胞的分化、凋亡、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，是免疫治療的理想靶抗原[14-15]。本研究利用軟件對EBV LMP2蛋白的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)10-82、90-109、173-179、199-205、235-241、289-294、379-383、413-421、484-494aa區(qū)段可能存在優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位，而CTL細(xì)胞表位和Th細(xì)胞表位可能分別位于119-127、311-319aa區(qū)段和224-232、333-34aa區(qū)段。這些表位與其他文獻(xiàn)報道[16]的表位區(qū)域存在部分差異，可能是預(yù)測方法的原理不盡相同，上述預(yù)測的表位序列在理論上是具有成為表位的特征，但還需要通過CTL殺傷實(shí)驗(yàn)或體內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠的進(jìn)一步驗(yàn)證。我們的研究可為尋找候選疫苗抗原提供更加豐富的研究基礎(chǔ)，為潛伏感染診斷標(biāo)志物的發(fā)掘以及診療抗體的研制提供一定依據(jù)和參考。

雖然有些多肽疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床研究，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還需鑒定及開發(fā)更多的表位，尤其是在人群中所占比例較高的HLA分子呈遞的表位，這些表位將為設(shè)計和研究更多理想的多肽疫苗奠定基礎(chǔ)。HLA是通過其多態(tài)性控制抗原肽的選擇性結(jié)合而影響細(xì)胞免疫的，因此HLA是病原易感性個體差異的主要決定者。不同人群中HLA基因頻率分布差異很大。本研究利用NetMHC和NetMHCII軟件分析發(fā)現(xiàn)與LMP2蛋白親和力較高的HLA分子等位基因是HLA-A*0201，并根據(jù)其在中國不同地區(qū)的基因頻率，預(yù)測出EB病毒可能在山西、北京、石家莊、天津、江蘇、廣州地區(qū)更易發(fā)生傳播。