新型歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 在畢赤酵母中的表達(dá)

張麗娟 吳唯維 李素一 陳 華 柯翎 林晨韜

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 福州 350003；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350007；3.福建師范大學(xué)南方海洋研究院福建省微藻種質(zhì)改良工程技術(shù)研究中心 福州 350117；4.福建師范大學(xué)福建省特色海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實驗室 福州 350117）

抗菌肽（Antimicrobial peptide）是一類由生物機(jī)體產(chǎn)生的具有抑菌活性的陽離子多肽類物質(zhì)， 是機(jī)體抵御病原菌感染的天然屏障之一。近年來，由于尋找抗生素替代物的迫切需求， 以及抗菌肽的抗菌活性高、抗菌譜廣、種類多、目標(biāo)菌株不易產(chǎn)生耐藥突變等特點(diǎn)， 其作為一種潛在的抗生素替代物越來越受到研究者的重視[1-2]。

目前， 抗菌肽的獲得方式主要是從生物體中提取、人工化學(xué)合成和構(gòu)建基因工程菌大量表達(dá)。其中從生物體中提取只能獲得少量抗菌肽，且操作復(fù)雜；人工化學(xué)合成抗菌肽成本高且與天然抗菌肽的結(jié)構(gòu)有差異；而構(gòu)建基因工程菌大量表達(dá)則具效率高、成本低且易操作等優(yōu)點(diǎn)。 基因工程表達(dá)主要包括原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)， 其中酵母表達(dá)系統(tǒng)作為常用的真核表達(dá)系統(tǒng)， 表達(dá)的抗菌肽更接近天然狀態(tài)， 并且操作簡單、 無毒副作用、 利于純化及工業(yè)化生產(chǎn)[3]。 Sun 等[4]利用畢赤酵母表達(dá)了融合蛋白抗菌肽乳鐵蛋白-溶菌酶， 具有良好的穩(wěn)定性。 Meng等[5]利用畢赤酵母重組表達(dá)的Hispidalin 具有廣譜的抗菌活性， 并且具有廣泛的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性。

我們前期從歐洲鰻鱺中發(fā)現(xiàn)一個新型抗菌肽elecilin，并對其進(jìn)行了原核表達(dá)，證實其對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用（另文發(fā)表）。 本研究利用酵母表達(dá)系統(tǒng)， 獲得了分泌到培養(yǎng)基中大量表達(dá)的elecilin， 為闡明其功能及其在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 畢赤酵母X-33 和酵母分泌表達(dá)載體pPICZaA 由本實驗室保存。 限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ、Taq DNA polymerase、T4 DNA 連接酶、DNA ladder 購自TaKaRa 公司；抗生素Zeocin、抗體anti-His 單克隆抗體購自Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽的序列特征分析 根據(jù)歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 基因編碼的氨基酸序列， 利用BioEdit 軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和親水區(qū)，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/在線預(yù)測信號肽信息，https://swissmodel.expasy.org/interactive 在線預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)，PROSITE 數(shù)據(jù)庫分析蛋白的活性區(qū)域。

1.2.2 基因序列合成與酵母分泌表達(dá)載體的構(gòu)建為利于抗菌肽的表達(dá)， 根據(jù)獲得的歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 的基因序列，及酵母表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性， 在不改變編碼氨基酸序列的基礎(chǔ)上合成去除信號肽的elecilin 基因序列，并在其上游與下游分別引入Xho Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點(diǎn)。 將合成的目的基因序列與Xho Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切回收的pPICZaA 在T4 DNA 連接酶作用下進(jìn)行連接，經(jīng)鑒定后，獲得質(zhì)粒pPICZaA-elecilin。

1.2.3 酵母菌的電擊轉(zhuǎn)化和陽性轉(zhuǎn)化子的PCR 篩選 按照電擊轉(zhuǎn)化步驟， 將質(zhì)粒pPICZaA-elecilin轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33 感受態(tài)中。 轉(zhuǎn)化后，均勻涂布于RDB 平板中，30 ℃培養(yǎng)3 d。 挑取若干單克隆酵母 菌， 用 引 物ɑ factor sequencing primer：TACTATTGCCAGCATTGCTGC 和 3' AOX primer：GCAAATGGCATTCTGACATCC 進(jìn)行PCR 驗證。

1.2.4 抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 鑒定 選取鑒定為陽性的克隆菌接種至BMGY 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至OD600為3.0 后，700 g/min 離心5 min， 收集菌體，并用新鮮的BMMY 培養(yǎng)基重懸菌體，至OD600為1.0，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)， 每隔24 h 添加甲醇溶液（100%） 至終濃度為1 %誘導(dǎo)蛋白表達(dá)， 誘導(dǎo)96 h后收集培養(yǎng)基， 用SDS-PAGE 鑒定抗菌肽表達(dá)情況。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 鑒定 分泌蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后， 電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上， 半干轉(zhuǎn)90 min 后，將PVDF 膜用封閉液封閉2 h，然后洗脫液PBST 洗脫4 次，每次5 min，將膜與一抗（His-tag單克隆抗體） 在室溫孵育1～2 h 后， 洗脫液洗脫（4 次，每次5 min），然后將膜轉(zhuǎn)移到二抗溶液（含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的馬抗鼠IgG）中，室溫孵育1～2 h， 接著洗脫液洗脫， 用ECL 顯色系統(tǒng)顯色，在BIO-RAD 中顯色后拍照。

2 結(jié) 果

2.1 歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 的基因序列特征分析歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 基因序列全長477 bp，編碼159 個氨基酸，理論分子量約為17.4 kDa（見圖1）。信號肽分析發(fā)現(xiàn)， 前30 位氨基酸為信號肽區(qū)域；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測， 該蛋白在84-106 區(qū)間是一個活性區(qū)域，含有2 個抗菌肽標(biāo)簽特征序列。

圖1 歐洲鰻鱺抗菌肽elecilin 的基因序列

2.2 酵母分泌表達(dá)載體的構(gòu)建與重組轉(zhuǎn)化子的PCR 鑒定 合成的elecilin 基因序列與酵母分泌表達(dá)載體pPICZaA 連接后， 得到elecilin 的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-elecilin。 將其電擊轉(zhuǎn)化至酵母菌X-33 中，在RDB 平板中培養(yǎng)3 d 后挑取單克隆，培養(yǎng)后， 用 引 物ɑ factor sequencing primer 和3' AOX primer 進(jìn)行PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示陽性克隆菌株擴(kuò)增出與目的基因大小一致的片段 （見圖2）。 進(jìn)一步的測序結(jié)果表明，elecilin 基因已成功整合到酵母基因組中， 將陽性轉(zhuǎn)化子命名為X-33/pPICZaA-elecilin。

圖2 重組菌株X-33/pPICZaA-elecilin 的PCR 鑒定

2.3 抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將重組酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)基進(jìn)行SDS-PAGE 分析和Western 鑒定。 結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中檢測到一個分子量約17 kDa 的蛋白表達(dá)（見圖3）。 進(jìn)一步根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物攜帶6×His 標(biāo)簽的特點(diǎn)，利用抗His-tag 單克隆抗體進(jìn)行Western blot 驗證，在約17 kDa 處的蛋白與該抗體特異性結(jié)合（見圖4），證明目的蛋白在酵母菌X-33 中成功表達(dá)。

3 討 論

圖4 Western blot 鑒定elecilin 的表達(dá)

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽超過3 000 種，其中動物源抗菌肽超過2 000 種。 雖然抗菌肽種類及數(shù)量在不斷增多，但是被廣泛應(yīng)用的卻很少，究其原因包括抗菌肽在機(jī)體內(nèi)的代謝情況尚不清楚、 安全性評價體系尚不完善、抗菌肽的生產(chǎn)成本高等[6]。 在抗菌肽的研究中， 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)因其操作簡單、表達(dá)高效、 且活性高等特點(diǎn)被廣泛用于抗菌肽的表達(dá)[7]。 本研究根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，在不改變elecilin 的編碼氨基酸序列基礎(chǔ)上，合成了去除信號肽的DNA 序列， 構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pPICZaAelecin，利用畢赤酵母X-33 進(jìn)行了表達(dá)，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE 與Western blot 鑒定，成功在畢赤酵母中表達(dá)了elecilin。 在此基礎(chǔ)上，我們將分析其抗菌譜，進(jìn)一步研究其功能，評估其在水產(chǎn)和畜禽等領(lǐng)域的應(yīng)用價值。