川芎嗪注射液通過激活Notch通路抑制心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞增殖、凋亡與壞死的作用研究

王顯鳳，王麟，劉存，田承亮

心肌梗死發(fā)病機(jī)制在于冠狀動脈（冠脈）粥樣硬化狹窄、斑塊破裂及血小板聚集和血栓形成，可引起心肌缺血、心肌細(xì)胞凋亡與壞死，嚴(yán)重危及患者生命安全[1,2]。細(xì)胞凋亡在心臟梗死向心力衰竭轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮重要作用，其中線粒體是調(diào)亡的控制中心，即心肌梗死發(fā)生后，機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)可損傷線粒體DNA，增加線粒體膜通透性，導(dǎo)致膜電位降低，觸發(fā)cytC進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與調(diào)亡蛋白相關(guān)激酶結(jié)合并活化caspase-9，從而導(dǎo)致調(diào)亡的發(fā)生[3]。川芎嗪注射液可改善局部微循環(huán)和能量代謝，保護(hù)心肌細(xì)胞，降低心臟負(fù)荷，已在心絞痛、心肌梗死等缺血性心血管疾病中療效顯著，但對于其具體作用機(jī)制尚未達(dá)一致意見[4]。Notch信號通路在調(diào)控心血管系統(tǒng)的生理、病理過程中發(fā)揮重要作用，如可通過調(diào)控下游NF-kβ信號通路而參與心室重構(gòu)，通過調(diào)控該通路可挽救受損心肌細(xì)胞，改善心室重構(gòu)和左心室舒張功能[5,6]。關(guān)于川芎嗪注射液對Notch信號通路的影響的報道并不多見，因此本文將通過大鼠心肌梗死模型進(jìn)一步研究川芎嗪注射液對Notch信號通路表達(dá)以及心肌細(xì)胞壞死、調(diào)亡的影響，從而為心肌梗死心室重構(gòu)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器10～12周齡的成年雄性SD大鼠（36只），體質(zhì)量180～220 g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，隨機(jī)分為3組，每組12只。大鼠置于SPF級實驗動物中心通風(fēng)飼養(yǎng)，室溫（21±2）℃，相對濕度40%～60%。川芎嗪注射液購自于吉林四長制藥有限公司，規(guī)格5 mg/支，批號2019041101。0.9%氯化鈉注射液購自于石家莊第四制藥廠。兔多克隆抗體cTnT、山羊抗兔二抗、Dylight 594標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購自于北京博奧森；二甲基亞砜、PBS、甲醇、戊巴比妥鈉等均購自于Sigma公司。ELISA試劑盒購自于武漢博士德生物工程有限公司。離心機(jī)、酶標(biāo)儀購自于美國Thermo公司；血液混勻儀購自于北京宏潤達(dá)科技發(fā)展有限公司；分析天平購自于梅特勒托利多公司；常規(guī)手術(shù)器械購自于上海手術(shù)器械廠；冰凍切片機(jī)購自于德國Zeis；心臟超聲診斷儀購自于美國GE公司；全自動生化分析儀購自于日本日立；分光光度計購自于美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死模型的建立大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，待麻醉起效后于頸正中開切口，氣管清晰暴露于視野后行氣管插管并連接至呼吸機(jī)。在大鼠左胸第4、5肋間開胸腔以便露出心臟，并于左心耳和肺動脈圓錐間進(jìn)針，于左前降支處采用0號線結(jié)扎，隨后縫合切口，可見結(jié)扎處變白，心電圖監(jiān)測可見胸前導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，表明干預(yù)組、模型組建模成立。對照組（假手術(shù)組）未給予結(jié)扎，其余操作與模型組一致。建模過程中干預(yù)組、模型組各有2只大鼠死亡，可用大鼠均為10只，對照組均成功。術(shù)后所有大鼠均肌注8萬單位青霉素。

1.2.2 給藥方法三組大鼠均于術(shù)后24 h給藥，其中干預(yù)組腹腔給予川芎嗪注射液，劑量為120 mg/kg，1/d，連續(xù)給藥3周，其余兩組給予等體積的生理鹽水，給藥頻率、周期與干預(yù)組一致，給藥期間密切關(guān)注大鼠生存情況及生理狀態(tài)。

1.3 評價指標(biāo)

1.3.1 心臟指標(biāo)評估于干預(yù)前、干預(yù)后1周、3周采用心臟彩色多普勒超聲儀器檢測心功能指標(biāo)。腹腔注射戊巴比妥鈉，待麻醉起效后固定在手術(shù)臺上，采用超聲儀獲取大鼠胸骨旁左心室長軸、乳頭肌水平短軸切面圖像，并測量心功能指標(biāo)，包括左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）。同時采集眼底靜脈血2 ml，血液標(biāo)本靜置1 h后，3000 r/min離心10 min，取上清液保存于-70℃待測。采用分光光度計測定氧化應(yīng)激指標(biāo)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），采用全自動生化分析儀測定心肌梗死標(biāo)志物，包括心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CKMB）。

1.3.2 心肌病理形態(tài)學(xué)給藥3周后頸椎離斷法處死，取出大鼠心臟，清理心臟周圍血液、血管結(jié)構(gòu)等，分離心肌梗死邊緣區(qū)結(jié)構(gòu)并置于多聚甲醛（4%）中固定48 h，隨后石蠟包埋，4 μm切片，并進(jìn)行HE、Masson染色，于顯微鏡下觀察心肌病理形態(tài)。

1.3.3 心肌細(xì)胞增殖采用免疫熒光實驗觀察3組大鼠心肌細(xì)胞的增殖情況，PCNA為細(xì)胞增殖核抗原，cTnT為心肌肌鈣蛋白，PCNA、cTnT均為陽性，表明存在新生心肌細(xì)胞。石蠟切片脫蠟后用PBS清洗，微波修復(fù)抗原后置于室溫下冷卻，PBS清洗3次，5 min/次，隨后用牛血清白蛋白封閉，甩去牛血清白蛋白后滴加小鼠來源的PCNA一抗（1:100）、兔源的cTnT一抗（1:100），置于4℃過夜，次日置于室溫30 min后PBS清洗，避光條件下滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:100）、Dylight 594標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（1:100）、DAPI（1:800），37℃放置1h后用PBS清洗3次，5 min/次，隨后封片，并于顯微鏡下拍片觀察，同時設(shè)置空白對照、陰性對照。

1.3.4 Notch信號通路相關(guān)基因表達(dá)采用實時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平。用Trizol試劑盒提取分離的心肌組織中總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用兩步法檢測Notchl、Hesl、DIM的mRNA表達(dá)水平，引物序列見表1。反應(yīng)條件：0.5 min×95℃預(yù)變性、5 s×95 ℃、0.5 min×60℃退火，共40個循環(huán)測定CT值。以β肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，Notch1、DII4、Hes1和β-actin基因相對表達(dá)量為2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，樣本量由檢驗效能分析結(jié)果決定，設(shè)定檢驗功效為0.90，檢驗水準(zhǔn)α為0.05，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較干預(yù)前對照組大鼠的LVEF明顯高于模型組、干預(yù)組，而LVEDd、LVESd明顯低于模型組、干預(yù)組（P＜0.05）。干預(yù)后對照組心功能指標(biāo)變化不顯著，模型組LVEDd、LVESd明顯增加，而LVEF明顯降低，而干預(yù)組LVEDd、LVESd明顯降低，LVEF明顯增加，且干預(yù)后各時間點均優(yōu)于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.2 各組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物水平比較干預(yù)前對照組大鼠的cTnT、cTnI、CKMB明顯低于模型組、干預(yù)組（P＜0.05）。干預(yù)后對照組心功能指標(biāo)指標(biāo)變化不顯著，模型組cTnT、cTnI、CKMB明顯增加，而干預(yù)組明顯降低，且干預(yù)后各時間點均優(yōu)于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

2.3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較干預(yù)前對照組大鼠的SOD、GSH-Px明顯高于模型組、干預(yù)組，而MDA明顯低于模型組、干預(yù)組（P＜0.05）。干預(yù)后對照組心功能指標(biāo)指標(biāo)變化不顯著，模型組SOD、GSH-Px明顯降低，而MDA明顯增加，而干預(yù)組SOD、GSH-Px明顯增加，MDA明顯降低，且干預(yù)后各時間點均優(yōu)于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表4）。

2.4 三組大鼠心肌組織病理形態(tài)比較心肌組織HE染色：對照組心肌橫紋清晰，細(xì)胞核大小、形態(tài)以及胞漿染色均一；模型組心肌梗死明顯，心肌纖維溶解，心肌橫紋消失，心肌細(xì)胞斷裂，且細(xì)胞核固縮。干預(yù)組心肌纖維、橫紋損傷程度明顯低于模型組（圖1A～C）。大鼠心肌組織Masson染色情況比較：膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色。對照組心肌細(xì)胞整齊排列，細(xì)胞間質(zhì)有少量的膠原纖維，模型組梗死區(qū)心肌細(xì)胞數(shù)目較少，細(xì)胞排列紊亂且呈肥大狀態(tài)，細(xì)胞間質(zhì)含有大量的膠原纖維。干預(yù)組梗死區(qū)心肌細(xì)胞數(shù)目適中，呈肥大狀態(tài)，膠原纖維呈分支狀，含量明顯低于模型組（圖1D～F）。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（）

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（）

注：LVEF：左室射血分?jǐn)?shù)；LVESd：左室收縮末期內(nèi)徑；LVEDd：左室舒張末期內(nèi)徑；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與干預(yù)前比較，cP＜0.05

表3 各組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物水平比較（）

表3 各組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物水平比較（）

注：cTnT：肌鈣蛋白T；cTnI：肌鈣蛋白I；CKMB：肌酸激酶同工酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與干預(yù)前比較，cP＜0.05

表4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（）

表4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（）

注：SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與干預(yù)前比較，cP＜0.05

2.5 三組大鼠心肌細(xì)胞增殖情況比較干預(yù)組心肌細(xì)胞增殖百分率明顯高于模型組、對照組，而模型組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.6 三組大鼠心肌細(xì)胞Notch信號通路相關(guān)mRNA表達(dá)量比較干預(yù)3周后干預(yù)組Notch1、DII4、Hes1 mRNA表達(dá)量均明顯高于模型組、對照組，而模型組Notch1、DII4、Hes1 mRNA表達(dá)量均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表5）。

3 討論

圖1 A～C為大鼠心肌組織病理學(xué)HE染色圖（×10），分別為模型組、干預(yù)組、對照組；D～F為大鼠心肌組織病理學(xué)Masson染色圖（×10），分別為模型組、干預(yù)組、對照組

圖1 心肌細(xì)胞增殖率

表5 三組大鼠心肌細(xì)胞Notch信號通路相關(guān)mRNA表達(dá)量比較（）

表5 三組大鼠心肌細(xì)胞Notch信號通路相關(guān)mRNA表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死后患者心肌損傷、心室重構(gòu)嚴(yán)重影響心肌舒張、收縮功能，因此改善心肌梗死后心肌損傷、心功能異常對于臨床治療至關(guān)重要[7,8]。川芎嗪是中藥材川芎中的活性成分，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激的作用，從而抑制血栓形成和降低血液黏度，改善微循環(huán)，其在缺血損傷方面可發(fā)揮保護(hù)作用，且臨床研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪注射液用于急性心肌梗死介入術(shù)患者，可加快心功能的恢復(fù)[8,9]。本次研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)前模型組、干預(yù)組大鼠的SOD、GSH-Px明顯低于對照組，而MDA明顯高于對照組，且干預(yù)組給予川芎嗪注射液后，氧化應(yīng)激指標(biāo)均水平明顯改善，表明川芎嗪注射液可有效改善大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而降低對心肌細(xì)胞的損傷。分析認(rèn)為局部缺血缺氧可激活機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致缺血部位細(xì)胞壞死、調(diào)亡，并產(chǎn)生大量的自由基，自由基會中和SOD、GSH-Px[10,11]，故而模型組、對照組干預(yù)前兩組水平明顯低于對照組。同時由于機(jī)體自身的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)不足以清除氧自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷持續(xù)進(jìn)展，細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的脂質(zhì)成分與自由基反應(yīng)，從而產(chǎn)生大量的MDA。干預(yù)組給予芎嗪注射液后可迅速改善局部缺血缺氧狀態(tài)，調(diào)控心肌細(xì)胞能量代謝，減輕心肌細(xì)胞損傷和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而使得SOD、GSH-Px、MDA水平顯著改善。cTnT、cTnI、CKMB是心肌細(xì)胞損傷相關(guān)血清標(biāo)志物，可在心臟壓力負(fù)荷過高和心肌細(xì)胞受損時由于負(fù)反饋機(jī)制而被心肌細(xì)胞釋放入血，導(dǎo)致血清處于高表達(dá)狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)其血清水平可反映心肌細(xì)胞受損程度[12,13]。本次研究發(fā)現(xiàn)給予川芎嗪注射液治療后，大鼠血清cTnT、cTnI、CKMB水平居顯著降低，進(jìn)一步表明川芎嗪注射液可保護(hù)受損心肌細(xì)胞，從而改善心臟功能，與張曉東研究相近[8]。心臟受到損傷時，心肌成纖維細(xì)胞被激活，并分泌大量的I型膠原蛋白，導(dǎo)致心肌纖維化，造成心臟重構(gòu)，從而引起心臟功能異常[14]，由于川芎嗪注射液可改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，避免心肌細(xì)胞受損，從而有效下調(diào)I型膠原蛋白的表達(dá)，降低心肌纖維化程度，故而使得心臟功能改善，LVEDd、LVESd、LVEF逐步恢復(fù)至正常狀態(tài)。

Notch信號通路由3部分組成，Notch受體、Notch配體和核效應(yīng)物，Notch信號通路參與心臟發(fā)育、心臟房室管、瓣膜及肌小梁的形成過程[15,16]，其中Notch受體以Notch1在心臟中的研究較為多見，如敲除Notchl基因小鼠心肌梗死模型的心肌肥厚反應(yīng)加劇，而半合缺失Notchl基因時梗死面積明顯大于對照組，Notchl信號表達(dá)上調(diào)是對心肌損傷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，可有效保護(hù)心肌細(xì)胞[17]。本次研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)3周后干預(yù)組大鼠Notch1、DII4、Hes1 mRNA表達(dá)量均明顯高于模型組、對照組，而模型組相關(guān)mRNA表達(dá)量均明顯高于對照組。干預(yù)后干預(yù)組、模型組的心肌損傷持續(xù)存在，故而Notch信號通路相關(guān)基因表達(dá)代償性上調(diào)，而干預(yù)組給予川芎嗪注射液其表達(dá)水平進(jìn)一步增加，有利于心肌細(xì)胞的新生以及降低心肌細(xì)胞受損程度，模型組的心肌損傷大于自我修復(fù)，故而心肌纖維溶解，心肌橫紋消失，心肌細(xì)胞斷裂，且細(xì)胞核固縮，且細(xì)胞排列紊亂且呈肥大狀態(tài)。晉金蘭等[17]認(rèn)為Notch信號通路可通過上調(diào)激活磷酸肌醇3激酶（P13K）/蛋白激酶（Akt）傳導(dǎo)通路而發(fā)揮抗細(xì)胞調(diào)亡的作用，還能直接調(diào)控凋亡、增殖蛋白（如細(xì)胞周期蛋白D1、Bcl-2）的表達(dá)而減輕心肌細(xì)胞凋亡，故而延緩心室重構(gòu)等。缺血性心肌梗死引發(fā)心肌細(xì)胞缺血、缺氧、壞死等嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而激活多種細(xì)胞凋亡相關(guān)因子（BAX、BCL-2、Caspase-3等），川芎嗪注射液可通過調(diào)控BAX、BCL-2、Caspase-3蛋白表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，從而改善血流變學(xué)狀態(tài)，同時還能調(diào)控心肌細(xì)胞的生物電位、神經(jīng)傳導(dǎo)功能，從而改善心肌收縮舒張功能等[18-21]。干預(yù)組大鼠經(jīng)過川芎嗪注射液治療后心肌調(diào)亡減低，Notch信號通路的上調(diào)可促進(jìn)心肌的再生，故而兩方面協(xié)同作用，改善心室重構(gòu)，利于心臟功能的恢復(fù)。

綜上所述，川芎嗪注射液通過激活Notch通路而促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和抑制心肌細(xì)胞損傷、凋亡，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善心臟功能，但川芎嗪注射液的心肌保護(hù)作用還需在人源心肌細(xì)胞中進(jìn)行驗證，且其詳細(xì)作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。