人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在帕金森病的應(yīng)用進(jìn)展

邵麗詩，馬逸群，梁磊，羅成誠(chéng)，王家平

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射科，云南 昆明650101；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，云南 昆明650000；3.臨滄市云縣人民醫(yī)院急診科，云南 臨滄675800）

帕金森病（Parkinson's disease PD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中第二常見的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其病理特征是黑質(zhì)多巴胺能（DA）神經(jīng)元進(jìn)行性損失及出現(xiàn)路易體[1]。PD的典型表現(xiàn)是靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)反射障礙異常的運(yùn)動(dòng)障礙和廣泛的非運(yùn)動(dòng)癥狀，其中認(rèn)知能力下降是最常見的非運(yùn)動(dòng)癥狀[2]。隨著我國(guó)人口老齡化的日益進(jìn)展，帕金森病的患病率和發(fā)病率呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)[3]。目前，PD的治療手段主要為口服左旋多巴的藥物治療[4-5]和深部腦刺激（DBS）[6]及手術(shù)等，以達(dá)到維持腦內(nèi)多巴胺和乙酞膽堿的相對(duì)平衡。但隨著時(shí)間的推移，PD患者的病情呈進(jìn)行性惡化[7-8]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也給患者家庭及社會(huì)帶來沉重經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)[9]。由于DA神經(jīng)元細(xì)胞一旦變性壞死則不可再生，細(xì)胞替代治療已被認(rèn)為是治療帕金森病的新方法[10]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）因具有顯著的神經(jīng)分化特征、免疫調(diào)節(jié)特征和向腦損傷源遷移等較多優(yōu)點(diǎn)己被認(rèn)為是治療PD的種子細(xì)胞之一[11]。本文對(duì)hUC-MSCs及其在帕金森病治療進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 hUC-MSCs的生物學(xué)特性及應(yīng)用

1.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞hUC-MSCs的概況MSCs是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，其存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。hUC-MSCs來源于包裹臍血管周圍的膠樣組織中，即華爾通膠或沃頓膠。早在2003年，Covas等[12-13]分別從人臍靜脈內(nèi)皮和內(nèi)皮下層成功分離得到hUC-MSCs。體外培養(yǎng)的hUC-MSCs呈貼壁生長(zhǎng)，鏡下呈形態(tài)相對(duì)均一的梭形細(xì)胞，也可見到多角形細(xì)胞。細(xì)胞周期分析顯示體外擴(kuò)增傳至30代的hUC-MSCs 80%處于G0～G1期，為正常二倍體，無形態(tài)學(xué)和增殖特性的改變[14]。與其他來源的MSCs一樣，hUC-MSCs高表達(dá)CD73、CD90、CD105，并表達(dá)粘附分子標(biāo)記如CD13、CD29、CD44，CD54，低表達(dá)HLA-ABC等MHC-Ⅰ分子標(biāo)記，不表達(dá)CD34、CD45和CD31等造血干細(xì)胞標(biāo)志及HLA-DR、HLA-DA、HLA-DP、HLA-DQ等MHC-Ⅱ分子標(biāo)記[15-16]。Hochedlinger等[17]發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性基因OCT-4，與維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)密切相關(guān)，表明臍帶hUC-MSCs具有干細(xì)胞特性。hUC-MSCs具有多分化潛能，可向外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞分化。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)hUCMSCs可分化為骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，體外誘導(dǎo)還可分化為成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、生殖細(xì)胞等[18-21]。

1.2 hUC-MSCs的應(yīng)用hUC-MSCs可能具有更強(qiáng)的可塑性和極低的免疫原性，已被許多學(xué)者認(rèn)為是應(yīng)用于細(xì)胞治療、組織工程和基因治療理想的靶細(xì)胞。近年來，hUC-MSCs開始用于治療心腦、神經(jīng)、免疫等疾病方面，并證實(shí)hUC-MSCs可促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生，調(diào)節(jié)血糖，修復(fù)創(chuàng)面和恢復(fù)神經(jīng)功能等，為現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)發(fā)展開拓新的領(lǐng)域。

hUC-MSCs與BMSCs、ADMSCs相比，具有以下優(yōu)勢(shì)：①不受倫理道德問題束縛；②hUC-MSCs從廢棄臍帶組織中獲取，來源廣泛，取材方便，分離提純工藝較簡(jiǎn)化，且無創(chuàng)操作，避免了骨髓穿刺痛苦；③從人臍帶獲取的間充質(zhì)細(xì)胞含量較高、增殖能力強(qiáng)；④免疫原性低，在異體移植間無免疫排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱；⑤易于轉(zhuǎn)染外源基因，可作為基因治療的載體，用于細(xì)胞治療和基因治療。近年來，隨著干細(xì)胞工程的不斷發(fā)展，來源于人臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)在組織工程領(lǐng)域較好的應(yīng)用前景。

2 hUC-MSCs與帕金森病

2.1 hUC-MSCs移植治療PD PD發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究認(rèn)為炎癥、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和促凋亡機(jī)制可能參與其病理過程。PD的主要病理改變是選擇性的中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元喪失，傳統(tǒng)的治療方法均無法逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性和增加DA神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目，因此，開發(fā)新型方法治療PD具有重要意義[22]。神經(jīng)細(xì)胞再生和修復(fù)缺損壞死的組織，是治療PD的理想方法[10]，因此，為更充分有效地利用細(xì)胞療法，需考慮神經(jīng)細(xì)胞的來源及其在物理和生物學(xué)上模擬宿主實(shí)質(zhì)組織的微環(huán)境[23]。hUC-MSCs由于可塑性強(qiáng)、免疫原性低、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)染外源基因容易等優(yōu)勢(shì)，已成為的理想靶細(xì)胞。截至目前，hUC-MSCs在治療PD研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要參考Shetty等[24]的方法制備PD模型，臨床試驗(yàn)主要采用在上平甲狀軟骨上緣，下至甲狀軟骨卜緣1 cm處行頸動(dòng)脈穿刺或第3、4腰椎間隙行蛛網(wǎng)膜下腔注射hUC-MSCs。2000年，Woodbury等[25]首次報(bào)道BMSC在體外通過誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞。Kopen等[26]通過將標(biāo)記的大鼠BMSC注射入新生小鼠的側(cè)腦室發(fā)現(xiàn)其能在體轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞。Fu等[18]將人臍帶MSCs來源的酪氨酸輕化酶陽性細(xì)胞移植至PD大鼠模型的紋狀體內(nèi)可存活4個(gè)月以上，并向移植部位的頭、尾兩側(cè)遷移約1.4 mm,苯丙胺誘發(fā)的大鼠轉(zhuǎn)圈行為顯著改善。這為尋找治療帕金森病的理想細(xì)胞指明了新的方向。Zhao等[27]在體外將hUC-MSCs誘導(dǎo)成多巴胺能神經(jīng)元（DAergic）與hUCMSCs比較對(duì)PD大鼠治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs誘導(dǎo)生成的DAergic對(duì)PD大鼠行為學(xué)癥狀明顯減輕，優(yōu)于直接應(yīng)用hUC-MSCs移植。hUC-MSCs在我國(guó)已開展至臨床試驗(yàn)階段，邱云等[28]經(jīng)頸動(dòng)脈注射hUC-MSCs治療8例PD患者，結(jié)果表明，患者的日常生活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)癥狀得到明顯改善。季興等[29]對(duì)38例PD患者行蛛網(wǎng)膜下腔注射hUC-MSCs，1個(gè)月后所有患者的UPDRS評(píng)分均顯著改善，隨訪期間未出現(xiàn)不良免疫反應(yīng)。但目前國(guó)外通過hUC-MSCs移植治療PD的報(bào)道較少。

2.2 hUC-MSCs作為轉(zhuǎn)基因載體治療雖然hUC-MSCs移植治療在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中領(lǐng)域取得了一些突破性進(jìn)展，但是移植后的hUC-MSCs存在生存率低、遠(yuǎn)期療效不明顯等問題。有研究利用hUC-MSCs作為基因治療的載體以此提高療效。黃仕雄等[30]將認(rèn)為能促進(jìn)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化有關(guān)的細(xì)胞核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子基因Nurrl進(jìn)行體外修飾hUC-MSCs，發(fā)現(xiàn)其較單純hUC-MSCs向DA神經(jīng)元分化率明顯增加，2009年，又發(fā)現(xiàn)移植Nurrl基因修飾hUC-MSCs來源的DAergic治療PD模型鼠，更能有效地促進(jìn)大鼠腦內(nèi)DA和紋狀體區(qū)酪氨酸輕化酶（tyrosinehydroxylase，TH）含量的表達(dá)[29]。樊志剛等[31]對(duì)PD大鼠有側(cè)腦室注射質(zhì)粒pEGFP-C2-TH基因修飾的hUC-MSCs后，觀察到移植的細(xì)胞活動(dòng)范圍更大，存活時(shí)間更長(zhǎng)相對(duì)于單純的hUC-MSCs。免疫組化顯示植入酪氨酸羥化酶基因修飾的的細(xì)胞TH表達(dá)陽性，移植后PD大鼠的紋狀體內(nèi)多巴胺含量也明顯增加，說明hUC-MSCs聯(lián)合基因治療PD的療效優(yōu)于單獨(dú)移植hUC-MSCs，為治療PD提供一種新的策略。除采用基因修飾的方法增加多巴胺的表達(dá)量治療PD外，還有一些研究發(fā)現(xiàn)移植前用多效生長(zhǎng)因子（pleiotro phin，PTN）預(yù)處理供體細(xì)胞，能更有效改善大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，促進(jìn)更多的TH陽性細(xì)胞存活[32]。

3 hUC-MSCs移植治療的機(jī)制

hUC-MSCs移植對(duì)治療PD有一定療效，但是其具體作用機(jī)制尚未完全闡明，可能通過以下幾種機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

3.1 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)移植后hUC-MSCs能到達(dá)局部損傷部位，通過分泌多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白和有效的神經(jīng)調(diào)節(jié)為神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)造有利環(huán)境的分子再生。hUCMSCs可向周圍釋放多種保護(hù)性因子，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3（NT3）、神經(jīng)遞質(zhì)因子（BDNF）、血管表皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、IL-6和干細(xì)胞因子（SCF）[33-34]等，這些細(xì)胞因子通過促進(jìn)血管再生和發(fā)揮抗炎、抗凋亡等從而挽救變性邊緣的DA神經(jīng)元，提高周圍神經(jīng)細(xì)胞的存活率。另外，hUC-MSCs可產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白質(zhì)，支持神經(jīng)細(xì)胞附著、生長(zhǎng)、神經(jīng)發(fā)生和功能修復(fù)[31]。因此，hUC-MSCs分泌的多種因子參與DA的保護(hù)和修復(fù)，這可能部分解釋了hUC-MSCs對(duì)PD的治療作用。

3.2 細(xì)胞替代移植的hUC-MSCs直接分化DAergic，或激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞間接分化為相應(yīng)類型的神經(jīng)細(xì)胞，替代缺失的DAergic。但目前越來越多的研究表明，細(xì)胞替代作用并不是hUC-MSCs作用的主要機(jī)制[35-36]。移植的hUC-MSCs在腦內(nèi)表達(dá)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物通常低于5%，且其數(shù)量在移植后會(huì)逐漸下降。因此，hUC-MSCs是否通過細(xì)胞分化替代改善神經(jīng)功能也有待進(jìn)一步研究。

3.3 免疫調(diào)節(jié)有研究表明，在PD患者尸檢中觀察到激活的小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛增殖[37]。炎癥刺激可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖效應(yīng)，hUC-MSCs可抑制這種增殖效應(yīng)并降低小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)促炎因子的表達(dá)[38]。同時(shí),在PD患者的大腦中檢測(cè)到促炎細(xì)胞因子水平的升高，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1）和干擾素γ（IFN-Y）[39-40]。此外，研究報(bào)道PD動(dòng)物模型的免疫抑制環(huán)孢菌素A的表達(dá)減弱[41]。說明hUCMSCs的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用在PD治療的重要性。

4 小結(jié)

近年來，干細(xì)胞作為一種有希望的修復(fù)性治療方法已經(jīng)成為PD研究領(lǐng)域的前沿，hUC-MSCs作為一種新型種子細(xì)胞，具有取材無創(chuàng)、無倫理爭(zhēng)議、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，尤其將分娩時(shí)遺棄的臍帶作為主要來源。同時(shí)，通過基因轉(zhuǎn)染手段，促進(jìn)hUC-MSCs定向分化為多巴胺能神經(jīng)元，為臨床治療PD提供新的思路。但hUC-MSCs治療如何獲得最有效的神經(jīng)保護(hù)作用的移植方案，以及移植時(shí)間窗、細(xì)胞數(shù)目、途徑、安全性等問題，還需要進(jìn)一步的研究。隨著人們對(duì)hUC-MSCs的生物學(xué)特性及臨床實(shí)踐不斷深入，我國(guó)規(guī)范的hUC-MSCs庫建立，未來hUC-MSCs將有望成為治療PD的恢復(fù)性方法。