上調(diào)A20表達(dá)對(duì)阿爾茨海默病小鼠海馬組織神經(jīng)元的保護(hù)作用*

孫麗慧 張萌 郎尉雅 王月靜 張海燕 馮化杰

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161001

阿爾茨海默病是一種神經(jīng)退行性疾病，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和變性，隨著年齡的增長(zhǎng)該病呈持續(xù)性的發(fā)展，目前全世界患病人數(shù)已達(dá)3000萬(wàn)人以上，阿爾茨海默病患者臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶力顯著下降，嚴(yán)重的患者不認(rèn)識(shí)自己的家人、朋友，導(dǎo)致其不能與人正常交流，很難照顧自己的生活起居，給患者的家屬增添了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。這使患者家屬的心理壓力不斷增加，給患者和家屬帶來(lái)痛苦，因此尋求有效的治療方法迫在眉睫，有研究發(fā)現(xiàn)ZBTB20缺陷導(dǎo)致了海馬發(fā)育的嚴(yán)重障礙，推測(cè)ZBTB20是調(diào)控海馬CA1神經(jīng)元的細(xì)胞命運(yùn)和海馬發(fā)育的關(guān)鍵分子。近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白在老年癡呆小鼠模型中有一定影響，但可能機(jī)制尚不清楚。鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育方面具有重要的作用。近年來(lái)已成功設(shè)計(jì)了特異性鋅指蛋白元件用于調(diào)節(jié)與疾病相關(guān)基因的表達(dá)，為臨床基因治療疾病提供了廣闊的前景。本研究構(gòu)建了鋅指蛋白A20基因重組腺病毒，進(jìn)一步研究上調(diào)鋅指蛋白A20表達(dá)是否修復(fù)阿爾茨海默病模型小鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷，為改善和修復(fù)受損的海馬神經(jīng)元提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 腺病毒載體A20 購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司，健康12w齡雄性 AD 小鼠，體質(zhì)量25-30 g，購(gòu)自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[可證號(hào) IACUC-DB-16-0602]。動(dòng)物在適應(yīng)環(huán)境 1周后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)均在標(biāo)準(zhǔn)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)前禁食 12 h，自由飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 將 30只小鼠隨機(jī)分3組：對(duì)照組，AD組，A20-AD組(海馬內(nèi)注射高表達(dá)A20慢病毒)，麻醉后用腦立體定位儀定位在海馬位置并固定，A20注入海馬內(nèi)，將攜帶高表達(dá)A20慢病毒注射海馬內(nèi)1min內(nèi)推完。

1.3甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)海馬組織神經(jīng)元變化 取材后取海馬組織，將組織制成蠟塊，用石蠟切片機(jī)切片、脫蠟、水化，染色后脫水，封片: 中性樹膠; 觀察海馬神經(jīng)元變化。

2 結(jié) 果

甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)海馬組織神經(jīng)元變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與AD組比較，A20-AD組海馬神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，損傷的神經(jīng)元被修復(fù)，神經(jīng)元形態(tài)變得規(guī)則飽滿，損傷神經(jīng)元數(shù)量減少，提示上調(diào)A20表達(dá)可修復(fù)阿爾茨海默病損傷的海馬神經(jīng)元。

3 討 論

阿爾茨海默病患者主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知障礙及精神行為異常，患者的生活質(zhì)量顯著下降,由于患者學(xué)習(xí)記憶力能力減退[1-2]，導(dǎo)致患者可能走失的概率增加，患者判斷力、語(yǔ)言能力減退及視空間障礙，這些癥狀可導(dǎo)致患者跌倒及發(fā)生意外，隨著病情逐漸加重，患者會(huì)出現(xiàn)精神障礙，如：焦慮、抑郁、睡眠障礙等[5-9]，阿爾茨海默病的主要病理特征為β-淀粉樣蛋白(amyloid-beta，Aβ)沉積于腦內(nèi)形成老年斑(senile plaques，SP)，以及大量神經(jīng)纖維纏結(jié)并伴隨著神經(jīng)元減少以及軸索和突觸異常、顆?？张葑冃缘取，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)AD的研究雖然已進(jìn)入到基因、分子水平，但其病因迄今不明[10-11]。一般認(rèn)為AD是復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，多種因素(遺傳因素、神經(jīng)遞質(zhì)、免疫因素、環(huán)境因素等)可能參與致病。現(xiàn)普遍認(rèn)同的發(fā)病機(jī)制一般有: Aβ學(xué)說(shuō)，Tau 蛋白學(xué)說(shuō)，載脂蛋白E基因，中樞膽堿能損傷，興奮性氨基酸毒性學(xué)說(shuō)，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，膽固醇代謝異常等?；颊邍?yán)重時(shí)需要照顧全部的日常生活，這給家屬帶來(lái)沉重的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這種疾病無(wú)特效藥物，因此，尋求有效的治療藥物至關(guān)重要，本研究構(gòu)建了鋅指蛋白A20基因慢病毒，進(jìn)一步研究上調(diào)鋅指蛋白A20表達(dá)是否修復(fù)阿爾茨海默病模型小鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷，鋅指蛋白A20的特點(diǎn)是什么呢？

A20最初作為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的TNF。誘導(dǎo)基因被發(fā)現(xiàn)，因此也被稱為TNFa誘導(dǎo)蛋白3( TNFAIP3)，A20蛋白的結(jié)構(gòu)域中包含N末端(1-385)和C末端(386-775)，其中N末端區(qū)具有一定的特征性，稱為特征性結(jié)構(gòu)區(qū)，該區(qū)域與已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都無(wú)同源性;另一端又稱C末端的結(jié)構(gòu)域?yàn)殇\指區(qū)，因此，A20又稱鋅指蛋白，A20是抑制多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的重要的抗炎分子，在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)A20上調(diào)，而A20與白介素受體1相關(guān)激酶(IRAK 1)的相互作用是內(nèi)毒素耐受的決定因素，在腸上皮細(xì)胞中，A20也具有誘導(dǎo)LPS耐受的功能。A20不僅具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，也是有效的腫瘤抑制因子，A20通過(guò)調(diào)節(jié)NF-KB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)發(fā)揮作用，鋅指蛋白A20可以連接到多種功能蛋白(如ABINs、LMP1、14-3-3等)，A20的鋅指區(qū)連接到這些功能蛋白后可發(fā)揮對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用[4]，有研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白在神經(jīng)細(xì)胞中能抑制細(xì)胞凋亡、壞死及炎性反應(yīng)等過(guò)程，前輩研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白A20在正常毛細(xì)胞中沉默表達(dá)，受到損傷后毛細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)鋅指蛋白A20的短暫表達(dá)，由于低量和短時(shí)間表達(dá)A20很難對(duì)毛細(xì)胞起到保護(hù)作用，上調(diào)A20的表達(dá)可對(duì)損傷細(xì)胞起到保護(hù)作用，這與我們的研究結(jié)果相似的，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)A20的表達(dá)可修復(fù)損傷的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，因此，我們初步探究作用，然而，它的具體作用機(jī)制還需要我們繼續(xù)研究。