鴨疫里默氏桿菌病和鴨圓環(huán)病毒病混合感染的實驗室診斷

袁林，張海，鄧珊珊，藺俐仲，袁標，羅登蕎，景書灝，徐春志，楊源，劉艷

（1.貴陽市息烽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 551100；2.貴陽市動物疫病預防控制中心 550081；3.貴陽市清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 551400；4.貴陽市草地站 550081）

近年來貴州大力發(fā)展生態(tài)家禽養(yǎng)殖業(yè)，但是由于養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展和養(yǎng)殖密度的增大，養(yǎng)鴨場常常發(fā)生各類疫病，其中鴨疫里默氏桿菌病和鴨圓環(huán)病毒， 已成為危害養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。 鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌引起的急性、敗血性、接觸性傳染病，又稱為鴨傳染性漿膜病。 主要臨床特征為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎，易感動物有雞、鴨、火雞等，其中對2～3 周齡雛鴨的最易感染。 該病自1904 年首次報道鴨疫里默氏桿菌，隨后在世界各國相繼發(fā)生。 鴨圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是目前已知最小的鴨病毒。 2020 年5 月貴州省某鴨場購進6 日齡雛鴨5000 只， 飼養(yǎng)至10 日齡時開始逐漸發(fā)病并有大量的雛鴨死亡， 雛鴨15 日齡時已死亡1000 余只。 病鴨臨床癥狀為病鴨被毛散亂、行動遲緩、站立不穩(wěn)、精神沉郁等，部分患鴨頭頸歪斜、臥地不起。 剖檢病死鴨可見腦組織水腫、病鴨脾臟腫大、附關節(jié)腫大等大體病變。 為進一步確診該養(yǎng)鴨場雛鴨異常死亡的病因， 采用了細菌分離鑒定、PCR 檢測、藥敏試驗和病毒核酸檢測等實驗室診斷方法， 為后期防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料

選擇患病雛鴨5 只，無菌采集心包液、肝臟組織、腦組織樣本。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

2×TaqPCRMasterMix、DNAMarkerDL2000、細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA 提取試劑盒、RNA 提取試劑盒、 禽流感病毒通用型核酸檢測試劑盒和新城疫病毒核酸檢測試劑盒均購自北京世紀元享公司；新生牛血清，購于浙江天杭生物科技有限公司；試驗所用的抗菌藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；巧克力培養(yǎng)基實驗室自制。

1.3 細菌分離培養(yǎng)

分別無菌接種5 只受檢鴨的心包液、 肝臟組織于巧克力瓊脂平板，置于燭缸中37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h。

1.4 細菌PCR 檢測

挑取純化培養(yǎng)的單個菌落到5%新生牛血清的液體培養(yǎng)物中，震蕩過夜培養(yǎng)。 參照細菌基因組提取試劑盒說明書提取細菌總DNA。 根據(jù)鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)基因設計特異性引物， 預擴增片段663bp； 鴨圓環(huán)病毒特異性引物目的片段338bp。 擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，觀察是否有特異性目的條帶。

1.5 細菌藥敏試驗

藥敏試驗采用藥敏紙片瓊脂擴散法， 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的標準進行，藥敏結(jié)果判斷標準按NCCLS2010 年標準，作出結(jié)果判斷。

1.6 病毒核酸檢測

取患鴨內(nèi)臟及腦組織樣本，加入適量PBS 緩沖液，研磨勻漿后， 離心取上清， 采用RNA/DNA 提取試劑盒分別提取病毒RNA/DNA， 進行禽流感病毒、 新城疫病毒和鴨圓環(huán)病毒核酸檢測。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)

經(jīng)37℃無氧過夜培養(yǎng)的巧克力瓊脂平板， 生長出表面光滑濕潤、邊緣整齊、半透明露滴狀菌落。 挑取單個菌落進行純培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢顯示分離菌為革蘭氏陰性短小桿菌。 初步判斷為鴨疫里默氏桿菌。

2.2 細菌PCR 鑒定

取PCR 擴增產(chǎn)物8μL， 于1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察， 結(jié)果顯示鴨疫里默氏桿菌陽性對照和分離菌樣本在663bp 處均出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果見圖1，可得本次厭氧分離得到的細菌為鴨疫里默氏桿菌。

圖1 分離菌PCR 擴增結(jié)果

2.3 細菌藥敏試驗

對分離得到的鴨疫里默氏桿菌分離株進行藥敏試驗， 結(jié)果為分離菌對頭孢拉定、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢哌酮等抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性。

2.4 病毒核酸檢測結(jié)果

對5 份病料組織進行禽流感病毒、 新城疫病毒和鴨圓環(huán)病毒核酸檢測，其中行禽流感病毒、新城疫病毒核酸檢測為陰性，5份樣本均擴增出與鴨圓環(huán)病毒預期相符的目的片段（圖2）。提示鴨群存在鴨圓環(huán)病毒感染。

圖2 鴨圓環(huán)病毒PCR 擴增結(jié)果

3 結(jié)論

采用細菌分離鑒定、PCR 檢測、 藥敏試驗和病毒核酸檢測等實驗室診斷方法， 確診該養(yǎng)鴨場雛鴨異常死亡的病因為鴨疫里默氏桿菌和鴨圓環(huán)病毒混合感染。 藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，分離菌對對頭孢拉定、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢哌酮等抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性。

4 討論

鴨圓環(huán)病毒病是免疫抑制病，感染可造成鴨淋巴組織損傷，導致鴨機體體液免疫和細胞免疫功能下降， 這種免疫抑制反應增強了其他共感染因素的致病性。 鴨圓環(huán)病毒常常與其他細菌性疾病和病毒性疾病混合感染，其中與大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌、鴨坦布蘇病毒、副黏病毒等的混合感染率較高。

鴨疫里默氏桿菌在國內(nèi)流行的血清型是1 型和2 型， 其他的10 種血清型也常伴隨發(fā)生。 疫苗免疫是預防鴨疫里默氏桿菌病的重要的手段和方法，但是由于血清型較多，且不同血清型之間交叉免疫效果不好。 養(yǎng)鴨場一旦發(fā)病，在臨床上主要采用抗生素藥物進行治療，但是由于大量抗生素藥物的濫用，造成了不同程度的耐藥。 因此選擇合適的敏感藥物，對治療和預防鴨疫里默氏桿菌病顯得至關重要。

由于目前針對鴨圓環(huán)病毒病和鴨疫里默氏桿菌病沒有有效的疫苗和藥物，要做好防控工作，首先必須做好引種檢疫和合群前隔離，加強養(yǎng)殖場生物安全體系建設和飼養(yǎng)管理水平；加強環(huán)境衛(wèi)生清潔和消毒，注意交替使用消毒藥物，避免產(chǎn)生耐藥性影響消毒效果；有效提高鴨群免疫力，切斷傳播途徑；同時養(yǎng)殖場也熒光積極開展鴨群疫病凈化工作；做好禽流感、新城疫等疫病的基礎免疫工作并加強免疫抗體監(jiān)測。