水浴法測定飼用植酸酶耐熱性方法的研究

邵 靜，于 靖，王 蕊，張 帥，王華明

（1.濰坊康地恩生物科技有限公司青島分公司，山東青島 266100；2.濰坊康地恩生物科技有限公司，山東濰坊 261500；3.青島蔚藍生物集團有限公司，山東青島 266100）

植酸酶能夠水解植酸或植酸鈉中的磷酸基團，最終生成無機磷和肌醇。植酸酶添加于畜禽飼料中，能夠有效提高有機磷利用率，降低無機磷的添加比例，既可降低飼料成本，又可減少畜禽養(yǎng)殖中污染物的排放。因此，植酸酶已經(jīng)成為必不可少的飼料組分，在飼料行業(yè)中廣泛應(yīng)用[1-3]。植酸酶添加到飼料中需要經(jīng)過高溫制粒等加工過程，耐高溫性能是評定植酸酶的重要指標。國內(nèi)外科研機構(gòu)不斷篩選和改造植酸酶生產(chǎn)菌種，研究植酸酶耐熱機制、獲得耐熱性更高的植酸酶[4-8]。因此，穩(wěn)定的耐熱性評價方法對于篩選工作的開展也尤為重要。目前，飼料和酶制劑行業(yè)對植酸酶耐高溫性能評價的主要方法有水浴法、干熱法和濕熱法[9-13]。其中，水浴法具有操作簡單、重復(fù)性好等特點，是篩選、評價耐高溫植酸酶通用的方法。但是，植酸酶是一種具有生物催化活性的酶蛋白，水浴法測定耐熱性的結(jié)果容易受到多種因素的影響。本試驗從水浴耐熱性處理的pH值、酶濃度、緩沖體系等方面對植酸酶耐熱性評價方法進行研究，旨在制定更加穩(wěn)定的植酸酶耐熱性評價標準，為酶制劑生產(chǎn)、應(yīng)用企業(yè)制定植酸酶耐熱性評價標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植酸酶A、B、C、D、E、F、H、J、K 購自國內(nèi)外酶制劑生產(chǎn)廠家；植酸鈉購自羅定市寶日植酸鈉有限公司。

1.2 試驗試劑

緩沖液Ⅰ為0.25 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值5.5。緩沖液Ⅱ為0.25 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，含有0.5 g/L 牛血清白蛋白、0.5 g/L 曲拉通X-100，pH 值5.5。耐熱稀釋緩沖液用于耐熱試驗中植酸酶的浸提和稀釋，酶溶解在該緩沖體系中進行耐熱性處理。

1.3 儀器設(shè)備

BSA224S-CW 分析天平（德國賽多利斯）、DK-98-Ⅱ-雙列四孔恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）、V-1800可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

植酸酶酶活力檢測依據(jù)《GB/T 18634—2009飼用植酸酶活性的測定分光光度法》。以植酸鈉為底物，在37 ℃、pH值5.5條件下，酶與底物反應(yīng)30 min，在酸性終止液中，產(chǎn)物無機磷與釩鉬酸銨生成黃色復(fù)合物，415 nm波長下測定吸光度。植酸酶酶活力定義為：每分鐘水解植酸鈉生成1 μmol無機磷的酶量定義為一個單位，以U表示。

植酸酶經(jīng)過多年的菌種開發(fā)與優(yōu)化，目前市售耐高溫植酸酶耐熱水平普遍較高，本研究中水浴耐熱性評價選擇水浴溫度為80 ℃和85 ℃。

式中：U為樣品水浴處理后酶活力；U0為樣品水浴處理前酶活力。

1.4.1 酶濃度對水浴法測定植酸酶耐熱性的影響

首先測定植酸酶A、B、C、D、E、F 的酶活力，根據(jù)初始酶活力，將樣品稀釋不同倍數(shù)使植酸酶酶活力為400、200、100、20 U/mL，作為待處理酶液備用。

以緩沖液Ⅰ為耐熱稀釋緩沖液，取4.5 mL耐熱稀釋緩沖液加入15 mm×100 mm 的玻璃試管中，置于80 ℃或85 ℃水浴中預(yù)熱10 min，加入0.5 mL待處理酶液，此時酶液的最終處理濃度分別為40、20、10、2 U/mL，準確計時5 min，將處理試管取出，立即放于冰水浴中冷卻至室溫。測定處理前后植酸酶酶活力，并計算耐溫率。

1.4.2 不同緩沖體系對水浴法測定植酸酶耐熱性的影響

分別選擇水、緩沖液Ⅰ、緩沖液Ⅱ為耐熱稀釋緩沖液，將植酸酶D、E、F 稀釋一定倍數(shù)，使其酶活為200 U/mL。取4.5 mL相應(yīng)的耐熱稀釋緩沖液加入15 mm×100 mm的玻璃試管中，置于80 ℃水浴中預(yù)熱10 min，加入0.5 mL待處理酶液，準確計時5 min，將處理試管取出，立即放于冰水浴中冷卻至室溫。測定處理前后植酸酶酶活力，并計算耐溫率。

1.4.3 pH值對水浴法測定植酸酶耐熱性的影響

選擇最適反應(yīng)pH值不同的3種植酸酶H、J、K，分別使用國家標準GB 18634—2009 緩沖液Ⅰ（pH 值5.5）和蔚藍標準緩沖液Ⅰ（pH 值5.0）作為耐熱稀釋緩沖液，浸提并稀釋植酸酶至200 U/mL，取4.5 mL 相應(yīng)的耐熱稀釋緩沖液加入15 mm×100 mm 的玻璃試管中，放于85 ℃水浴中預(yù)熱10 min，加入0.5 mL 待處理酶液，準確計時5 min，將處理試管取出，立即放于冰水浴中冷卻至室溫。測定處理前后植酸酶酶活力，并計算耐溫率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理液酶活對植酸酶耐熱性的影響

將酶稀釋到不同酶活力濃度，經(jīng)水浴加熱處理后，不同酶制劑所表現(xiàn)的耐熱性不同，見表1。

由表1 可知，80 ℃水浴處理時，植酸酶A、B 耐熱性較差，耐溫率低于50%。此時，隨著處理液酶濃度的降低，植酸酶的耐熱性明顯提高。植酸酶C、D、E耐熱性較好，耐溫率高于60%，處理液的酶濃度對植酸酶耐熱性基本沒有影響。

85 ℃水浴處理時，植酸酶A、B、C耐熱性較差，其耐熱性同樣隨著處理液酶濃度的降低而升高。植酸酶D、E 耐熱性較好，結(jié)果不受處理液酶濃度影響。

由此可見，植酸酶水浴耐熱性結(jié)果受處理液酶濃度的影響，對耐熱性較差的酶樣品明顯。原因可能是由于在高溫條件下分子熱運動劇烈，分子間相互碰撞更加強烈，當酶蛋白三級結(jié)構(gòu)因受到高溫作用而不穩(wěn)定時，強烈的分子間作用力會增加三級結(jié)構(gòu)的破壞。酶濃度低時，分子間作用力減少，對酶蛋白的三級結(jié)構(gòu)的破壞相對減少。因此，制定水浴法測定植酸酶制劑產(chǎn)品耐熱性檢測方法時，需要考慮這個因素，在確保處理液酶濃度一致的條件下測定耐熱性。

表1 不同處理液酶活對植酸酶耐熱性的影響Tab.1 Effect of different dilution on the temperature-resistance of phytase

2.2 不同緩沖體系對水浴法測定植酸酶耐熱性的影響

使用不同耐熱稀釋緩沖液稀釋植酸酶，80 ℃水浴處理5 min，結(jié)果見表2。

表2 不同緩沖體系對水浴法測定植酸酶耐熱性的影響Tab.2 Effect of different buffer systems on the determination of heat resistance of phytase by water bath

由表2 可知，植酸酶D、E、F 耐溫率分布在50%～97%之間，以緩沖液Ⅰ作為稀釋緩沖液時植酸酶耐熱性最好，其次是緩沖液Ⅱ，以水作為稀釋緩沖液時的耐熱性耐溫率最低。推其原因是緩沖液中含有鹽離子，能夠增強蛋白質(zhì)的剛性[6]，并且能夠提供相對穩(wěn)定的pH 值條件，對酶蛋白具有一定的穩(wěn)定作用。另一方面，緩沖液Ⅱ含有一定濃度的牛血清白蛋白和曲拉通X-100，這兩種物質(zhì)在測定植酸酶酶活力的時候具有增溶劑的效果，但是在高溫水浴處理的時候，高濃度的牛血清白蛋白可能增加分子間相互作用，大量的蛋白分子間相互碰撞增加了植酸酶失活率。因此，在水浴法測定植酸酶耐熱性時，建議使用只含有鹽的緩沖液Ⅰ作為稀釋緩沖液，減少引入其他物質(zhì)、避免對耐熱處理過程產(chǎn)生干擾。

2.3 pH值對水浴法測定植酸酶耐熱性的影響

選擇最適pH 值不同的3 種植酸酶，在不同pH 值條件下進行水浴耐熱性處理，85 ℃處理5 min 測定耐熱性，見表3。

表3 pH值對水浴法測定植酸酶耐熱性的影響Tab.3 Influence of pH value on the determination of heat resistance of phytase by water bath method

由表3可知，植酸酶H的最適pH值為5.5，其pH值5.5條件下測定耐熱性比pH值5.0測定時高約15%；植酸酶J、K 的最適pH 值為4.0～4.5，使用蔚藍標準pH 值5.0 條件處理時，耐熱性比國標條件高10%～20%。

因此，在接近植酸酶最適pH 值條件下進行耐熱性處理，測得的耐熱性結(jié)果一般會相對較高。但是以往對植酸酶的評價中也發(fā)現(xiàn)存在部分穩(wěn)定性好的植酸酶，對pH 值不敏感，在本研究的兩種pH 值條件下處理耐熱性結(jié)果差別不大。

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，緩沖體系中酶濃度越低，耐熱處理緩沖液中成分越簡單，檢測到的植酸酶耐熱性越高，處理條件在酶的相對穩(wěn)定的條件時，耐熱性結(jié)果越高。最適pH 值條件下進行耐熱性處理，耐溫率相對較高。酶作為一種活性蛋白，酶活力測定就會受到多種成分的干擾，耐熱性是在高溫抗逆條件下對酶進行處理，檢測更容易受到干擾。

除了本研究所測定的3 種條件，比如酶制劑的載體成分、加熱處理的時間，處理液的體積、加入處理時所使用試管的規(guī)格等因素都會對耐熱性結(jié)果有一定的影響。作為酶制劑的生產(chǎn)、應(yīng)用企業(yè)，在使用水浴法評價酶制劑熱性時，需要制定詳細的標準化方法才能保證每次檢測獲得較好的重復(fù)性和平行性。