脂肪酶催化合成對(duì)映純硫雜環(huán)戊烷動(dòng)力學(xué)模型

唐慧 王繁業(yè)

摘要：? 為有效提高醫(yī)藥中間體對(duì)映純1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷（PR）的產(chǎn)率，本研究對(duì)動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分，制備PR，并建立其動(dòng)力學(xué)模型。采用一鍋法合成對(duì)映純（（R）-5乙酰氧基-1，3-氧雜噻喃-2-基）乙基苯甲酸酯（PR），其中，催化劑為固定化絲孢酵母脂肪酶（Trichosporonlaibachii CBS 5791），底物為2-（苯基甲氧基）乙醛（A），1，4-二硫-2，5-二醇（B）和乙酸苯酯（D）。研究結(jié)果表明，其轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到99.6%，產(chǎn)率為97.3%，對(duì)映體過量百分率（enantiomeric excess，ee%）為96.5%，所建立的反應(yīng)體系動(dòng)力學(xué)模型，很好地?cái)M合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，表明可逆半硫代乙縮醛轉(zhuǎn)化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)遵從冪律方程，而酶催化內(nèi)酯化反應(yīng)為帶產(chǎn)物抑制的序列機(jī)制。該研究可高效合成PR，最大限度地提高了生產(chǎn)效率。

關(guān)鍵詞：? 動(dòng)力學(xué)模型;? 脂肪酶;? 半硫縮醛轉(zhuǎn)化;? 1，3-氧硫雜環(huán)戊烷;? 酶促對(duì)映選擇性合成

中圖分類號(hào)： TQ463+.21; O643.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

作者簡(jiǎn)介： ?唐慧（1995-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樗幬锖铣伞?/p>

通信作者： ?王繁業(yè)（1965-），男，博士，教授，主要研究方向?yàn)橹扑幑こ毯退幬锘瘜W(xué)。? Email： fywang8209@163.com

手性1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷是許多藥物的重要中間體，如拉米夫定是用于治療HIV感染和慢性乙型肝炎最有效的藥物之一[1]。酶促不對(duì)稱合成或拆分制備對(duì)映體純1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷，由于其良好的立體選擇性，高效、溫和的反應(yīng)條件和環(huán)境友好性而受到廣泛關(guān)注[24]。Ren Y等人[1]通過多酶級(jí)聯(lián)的方法，使用表面活性劑處理枯草桿菌蛋白酶嘉士伯和南極假絲酵母脂肪酶B，制備對(duì)映體（2R，5R）-1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷，使ee%>99%;Chen Y等人[5]通過產(chǎn)酸克雷伯菌介導(dǎo)的全細(xì)胞催化制備對(duì)映體富集的拉米夫定前體;Hu L等人[6]提出了加成-環(huán)化-乙?；磻?yīng)，采用新型表面活性劑處理的枯草桿菌蛋白酶，催化動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分制備1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷。近年來(lái)，動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分已在許多復(fù)雜的拆分系統(tǒng)中使用[69]，但目前酶法合成手性1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷中間體仍無(wú)法達(dá)到滿意的對(duì)映體純度和產(chǎn)率。通過不同酶可以獲得不同構(gòu)型的對(duì)映體，例如，枯草桿菌蛋白酶通過催化拉米夫定前體進(jìn)行不對(duì)稱合成生成拉米夫定，而南極假絲酵母的脂肪酶B、洋蔥伯克霍爾德氏菌和熒光假單胞菌的脂肪酶催化結(jié)果則與拉米夫定優(yōu)勢(shì)構(gòu)型相反[2，10]。T. laibachii已成功用于酮戊芬[11]的拆分和ε-己內(nèi)酯的原位開環(huán)聚合反應(yīng)[12]?；诖?，本文建立了脂肪酶催化合成對(duì)映純硫雜環(huán)戊烷動(dòng)力學(xué)模型，該反應(yīng)是加成-環(huán)化-乙?；磻?yīng)[6]，反應(yīng)中需要考慮不同組分之間存在的相互作用[13]，可能的反應(yīng)機(jī)制包括乒乓（Bi-Bi）機(jī)制[14]或三元復(fù)合機(jī)制（有序和隨機(jī)順序Bi-Bi）[15]。分析結(jié)果表明，本研究所建立的動(dòng)力學(xué)模型，可揭示手性1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷的反應(yīng)機(jī)理。該研究對(duì)提高反應(yīng)速率具有重要意義。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)材料及分析測(cè)試/實(shí)驗(yàn)材料和儀器

2-（苯基甲氧基）乙醛（99%），1，4-二硫-2，5-二醇（98%）和乙酸苯酯（99%）購(gòu)于阿拉丁公司。以比活力為1 280 U/g的交聯(lián)固定化T. laibacchiii CBS5791脂肪酶為催化劑，使用前將催化劑真空干燥2 d。采用原位固定化方法制備了交聯(lián)固定化T. laibacchii CBS5791脂肪酶[16]。對(duì)于（（R）-5-乙酰氧基-1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷-2-基）苯甲酸乙酯（PR）和（（S）-5-乙酰氧基-1，3-氧雜硫雜環(huán)戊烷-2-基）苯甲酸乙酯（PS），采用高效液相色譜（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析，HPLC為Agilent RRLC 1200，色譜柱保持在30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。采用Chiracel OJ-H柱（4.6 mm×250 mm），進(jìn)樣體積為5 μL，流動(dòng)相為正己烷∶2-丙醇（即體積比為92∶8），流速為0.8 mL/min。采用氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）分析2-（苯基甲氧基）乙醛和苯酚的濃度，SHIMADZU GC-2010 plus的毛細(xì)管柱為HP-FFAP（Agilent，內(nèi)徑30 mm×0.25 mm，薄膜0.25 μm）。通過程序升溫，首先將柱溫150 ℃維持在2 min，以10 ℃/min升至200 ℃，并保持1 min，以10 ℃/min升至270 ℃，然后保持15 min。將氮?dú)庾鳛檩d氣，在分流模式下，噴射器溫度為250 ℃，分流比為20，火焰離子化檢測(cè)儀（Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID）的溫度保持在270 ℃。

1.2酶法合成（（R）-5-乙酰氧基-1，3-氧雜硫雜環(huán)戊-2-基）苯甲酸乙酯

固定化絲孢酵母脂肪酶催化的一鍋法反應(yīng)步驟如下，將10 mL反應(yīng)瓶置于水浴搖床，搖床轉(zhuǎn)速50～250 r/min，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時(shí)間48 h。反應(yīng)體系中，2-（苯基甲氧基）乙醛的濃度為1.6 mmol/L，1，4-二硫-2，5-二醇的濃度為0.8 mmol/L，三乙胺的濃度為0.65 mmol/L，乙酸苯酯的濃度為3.55 mmol/L和四氫呋喃的體積為5 mL，其初始水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.46%。加入酶引發(fā)反應(yīng)，酶濃度為1～6 U/mL。反應(yīng)結(jié)束后，過濾分離脂肪酶，將30 mL乙酸乙酯加入濾液，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。將洗滌的濾液離心分離為水相和有機(jī)相，水相用乙酸乙酯（30 mL）萃取兩次，最后將合并的有機(jī)相用飽和氯化鈉洗滌，洗滌的有機(jī)相經(jīng)硫酸鎂干燥。真空除去溶劑，并將粗產(chǎn)物使用柱色譜法純化（己烷∶乙酸乙酯=6.5∶1）。

1.3內(nèi)、外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

使用不同粒徑的脂肪酶進(jìn)行內(nèi)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，以研究脂肪酶的粒徑對(duì)化學(xué)-酶系統(tǒng)反應(yīng)速率的影響。酶的粒徑為250～850 μm，搖床轉(zhuǎn)速為50～250 r/min，進(jìn)行了外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，以研究轉(zhuǎn)速對(duì)PR的影響。在內(nèi)、外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中，除了反應(yīng)時(shí)間為6.0 h外，其他反應(yīng)條件與1.2相同。

2模型

2.1反應(yīng)機(jī)理和模型

脂肪酶催化合成PR的反應(yīng)路線如圖1所示[11]，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分體系，包含3個(gè)反應(yīng)，其中一個(gè)是可逆的半硫代縮醛轉(zhuǎn)化，兩個(gè)是脂肪酶催化的內(nèi)酯化反應(yīng)，生成兩個(gè)對(duì)映體。

對(duì)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行假設(shè)，生成最終產(chǎn)物PR，PS和P1的最后一步是不可逆反應(yīng)，所建立的動(dòng)力學(xué)模型被認(rèn)為是固有的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，這一假設(shè)將在隨后的內(nèi)部和外部質(zhì)量擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證;在整個(gè)反應(yīng)過程中，酶活性的損失可以忽略不計(jì)。本研究反應(yīng)后固定化脂肪酶的剩余活力大于95.4%，反應(yīng)體系溫和[1718]，并沒有像過氧化物或者酸性物質(zhì)那樣導(dǎo)致酶的失活。該反應(yīng)中，一種酶同時(shí)催化反應(yīng)式（2）和式（3），具有相同的脂肪酶活性位點(diǎn)，兩個(gè)平行反應(yīng)交織在一起。反應(yīng)式（2）和式（3）中沒有離去基團(tuán)不遵循Bi-Bi機(jī)制，離去基團(tuán)是Bi-Bi機(jī)制的特征之一[14]。因此，本研究將考慮順序機(jī)制[15]。CR和CS底物的濃度應(yīng)近似，因?yàn)榉磻?yīng)式（2）和式（3）是可逆的半硫縮醛轉(zhuǎn)化。因此，在建立動(dòng)力學(xué)方程式時(shí)，CR和CS并未被作為兩個(gè)真正獨(dú)立的底物處理，在建立反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型時(shí)，可減少動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)。

反應(yīng)式（1）采用帶有可逆項(xiàng)的冪律方程作為動(dòng)力學(xué)方程。反應(yīng)式（2）給出了序列反應(yīng)機(jī)制，用于脂肪酶催化的環(huán)化和酯化序列反應(yīng)機(jī)制如圖2所示。首先，底物D與脂肪酶E結(jié)合形成ED，ED與CR結(jié)合，產(chǎn)生脂肪酶三元復(fù)合物EDCR，將EDCR轉(zhuǎn)換為EP1PR，產(chǎn)物PR從EP1PR釋放，剩下EP1。最后EP1釋放產(chǎn)物P1，酶E再轉(zhuǎn)化為原始形式。反應(yīng)式（3）與反應(yīng)式（2）類似。式中，k1～k6和k-1～k-6為速度常數(shù)項(xiàng)與底物/產(chǎn)物濃度項(xiàng)的乘積。

3結(jié)果和討論

3.1內(nèi)、外擴(kuò)散的影響

由于使用了多孔載體的固定化脂肪酶，因此有必要進(jìn)行內(nèi)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。A，B和D初始摩爾濃度分別為0.288，0.144和0.64 mmol/L，固定化脂肪酶的濃度為6.0 U/mL。當(dāng)溫度為40 ℃，攪拌速度為150 r/min，給出不同固定化脂肪酶粒徑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定化酶粒徑對(duì)PR產(chǎn)率的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著固定化酶粒徑從0.5 mm增加到0.85 mm，PR的產(chǎn)率從46.1%逐漸降低至28.1%，說明在此粒徑范圍內(nèi)，粒徑的增加與PR的產(chǎn)率成反比，酶催化受擴(kuò)散限制。因此，如果粒徑大于0.5 mm，內(nèi)擴(kuò)散對(duì)PR產(chǎn)率的影響較大。由圖3還可以看出，當(dāng)珠粒徑在0.25～0.5 mm之間變化時(shí)，內(nèi)部傳質(zhì)對(duì)PR產(chǎn)率的影響可以忽略。因此，在隨后的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，選擇酶大小為0.5 mm。研究表明，如采用合適的酶粒徑和酶載荷，可以忽略多孔載體固定化酶的內(nèi)傳質(zhì)限制[21]。

3.2外擴(kuò)散的影響

在固液酶促反應(yīng)中，降低外擴(kuò)散的影響對(duì)于提高反應(yīng)速率具有重要意義，因此，酶促反應(yīng)需要在最佳攪拌速度下進(jìn)行[19]。為研究外擴(kuò)散對(duì)PR產(chǎn)率的影響，在50～250 r/min轉(zhuǎn)速下進(jìn)行外擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。當(dāng)溫度為40 ℃，粒徑為0.5 mm，E0=6 U/mL時(shí)，攪拌速度對(duì)PR產(chǎn)率的影響如圖4所示。由圖4可以看出，當(dāng)攪拌速度從50 r/min增加到150 r/min，PR產(chǎn)率從20.1%增加到46.2%時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)PR產(chǎn)率有較大的影響，反應(yīng)受外擴(kuò)散限制。然而當(dāng)速度從150 r/min增加到250 r/min時(shí)，PR產(chǎn)率變化較小，這意味著外擴(kuò)散影響可以忽略。因此，本實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)速度是150 r/min。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)酶粒徑和攪拌轉(zhuǎn)速分別為0.5 mm和150 r/min時(shí)，內(nèi)、外擴(kuò)散阻力均可以忽略，故所研究的是固有動(dòng)力學(xué)模型。

3.3動(dòng)力學(xué)模型

優(yōu)化式（4）～式（13），優(yōu)化后的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)如表1所示。PR和PS產(chǎn)率模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較如圖5所示，由圖5可以看出，PR和PS的產(chǎn)率分別為97.3%和1.82%，ee%值為96.5%，取得很好的動(dòng)態(tài)共價(jià)動(dòng)力學(xué)拆分效果。由于脂肪酶的高選擇性，PR的產(chǎn)率遠(yuǎn)高于PS，從而得到高ee%。影響對(duì)映選擇性的另一個(gè)因素是底物結(jié)構(gòu)。在本研究中，選擇結(jié)構(gòu)比乙二醇醛二聚體大的2-（苯基甲氧基）乙醛與1，4-二硫-2，5-二醇反應(yīng)，能更適合于酶的活性位點(diǎn)[6]。

A和B剩余率模擬值和實(shí)驗(yàn)值如圖6所示。由圖6可以看出，由于A、B采用等反應(yīng)量進(jìn)料，兩條剩余率曲線重合，A的最終剩余率為0.4%，相應(yīng)轉(zhuǎn)化率為99.6%。

當(dāng)條件溫度為40 ℃，粒徑為0.5 mm，攪拌速度為150 r/min，E0=6 U/mL時(shí)，P1和B的模擬值和實(shí)驗(yàn)值的比較如圖7所示。由圖7可以看出，模擬值和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的平均和最大相對(duì)偏差分別為8.9%和65.7%。最大相對(duì)偏差出現(xiàn)在低PR產(chǎn)率或A、B剩余率處，例如，在PR的低產(chǎn)率下，即使較小的偏差值也會(huì)產(chǎn)生較大的相對(duì)偏差，因?yàn)檩^小的PR是分母。盡管最大相對(duì)偏差為65.7%，但這并不意味著所建立的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得不好，而且模擬值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的偏差分布為零軸對(duì)稱，進(jìn)一步表明，該模型很好擬合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)于研究酶反應(yīng)機(jī)制十分重要[21]，模型很好擬合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，說明設(shè)定的反應(yīng)機(jī)制是正確的。反應(yīng)式（1）遵循冪定律，反應(yīng)式（2）和式（3）的酶催化反應(yīng)，則是帶有產(chǎn)物抑制順序機(jī)制。在許多由酶催化的動(dòng)力學(xué)模型中，經(jīng)常使用順序機(jī)制[15]。K13y（8）A0為反應(yīng)式（2）和式（3）的產(chǎn)物P1抑制項(xiàng)，而K13是P1的產(chǎn)物抑制系數(shù)。與其他常數(shù)相比，K13數(shù)值較大，因此P1的產(chǎn)物抑制對(duì)反應(yīng)具有較強(qiáng)的影響（見表1）。

實(shí)際上，在建立化學(xué)酶動(dòng)力學(xué)模型時(shí)，還考慮了底物抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制等因素。不同動(dòng)力學(xué)模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示。表2中，模型方程式分母不同，但分子相同。根據(jù)模擬和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的平均相對(duì)偏差，判斷模型是否合適的標(biāo)準(zhǔn)分為四個(gè)等級(jí)，即非常好（<10%）、好（<15%）、較差（<20%）和差（>20%）。由表2可以看出，不同模型的差別僅出現(xiàn)在式（6）的分母上，如果添加底物抑制或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，則式（6）分母將改變。其中，只有模型原型（式（6））可以很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而其他5個(gè)模型擬合較差。說明P1苯酚產(chǎn)物抑制的假設(shè)可以接受，而其他假設(shè)，即A和B的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、PR和PS產(chǎn)物抑制以及CR，CS和D底物抑制的假設(shè)是錯(cuò)誤的。而具有底物抑制作用的脂肪酶介導(dǎo)的ε-己內(nèi)酯合成動(dòng)力學(xué)模型[20]，其脲素過氧化氫酶和乙酸都具有較強(qiáng)的底物抑制作用。

對(duì)于化學(xué)-酶反應(yīng)，存在三種可能的情況，酶促反應(yīng)抑制;酶與化學(xué)反應(yīng)抑制;化學(xué)反應(yīng)抑制。前兩種情況增加酶濃度，可減輕由酶促反應(yīng)引起的抑制，并提高酶促反應(yīng)的速率。當(dāng)E0為6 U/mL時(shí)，PR的產(chǎn)率為97.3%，而當(dāng)E0為2 U/mL時(shí)，PR的產(chǎn)率僅為89.2%，這表明隨著E0的增加，反應(yīng)產(chǎn)率增加，即增加脂肪酶的量能加快酶促內(nèi)酯化，使PR產(chǎn)率增加。中間體CR與反應(yīng)式（1）和式（2）有關(guān)，其中反應(yīng)式（1）生成CR，而反應(yīng)式（2）消耗CR。因此，在動(dòng)態(tài)共價(jià)動(dòng)力學(xué)拆分系統(tǒng)中，CR的量由兩個(gè)反應(yīng)確定，CR和CS的比較如圖8所示。

由圖8可以看出，在反應(yīng)的初始階段，CR迅速增加，因?yàn)榉磻?yīng)式（1）立即開始生成CR，而消耗CR的反應(yīng)式（2）有延遲。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，CR升高到一定水平時(shí)，反應(yīng)式（2）的速率迅速增加，并超過反應(yīng)式（1）的速率。結(jié)果消耗的CR多于生成的CR，CR隨著時(shí)間下降。CS與CR相似，但反應(yīng)式（3）比反應(yīng)式（2）慢，消耗的CS更少。CS主要通過反應(yīng)式（1）的可逆反應(yīng)返回起始原料，因此CS在系統(tǒng)中高于CR。

4結(jié)束語(yǔ)

本研究將可逆半硫代乙縮醛轉(zhuǎn)化與脂肪酶催化對(duì)映選擇性內(nèi)酯化反應(yīng)結(jié)合，構(gòu)成了動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分體系，采用一鍋法絲孢酵母脂肪酶催化，制備了對(duì)映純PR。研究結(jié)果表明，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.6%，產(chǎn)率達(dá)97.3%，對(duì)應(yīng)體過量百分率達(dá)96.5%。本文首次建立的化學(xué)-脂肪酶動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分體系的固有動(dòng)力學(xué)模型，很好地?cái)M合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)揭示了酶催化內(nèi)酯化是反應(yīng)限制環(huán)節(jié)，因此增加脂肪酶的量，可以加速反應(yīng)，從而使PR產(chǎn)率顯著提高。

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Abstract：?? In order to effectively improve the yield of enantiomeric 1， 3-oxathiolane （PR） of pharmaceutical intermediates， dynamic covalent kinetic resolution was performed in this study to prepare PR and establish its kinetic model. Using one-pot process， enantiopure （（R）-5-acetoxy-1， 3-oxathiolan-2-yl） ethyl benzoate （PR） was synthesized with 99.6% conversion， 97.3% yield and 96.5% ee.， and it was performed using an enzyme called Trichosporonlaibachii CBS 5791， with substrates of 2- （phenylmethoxy） acetaldehyde （A）， 1， 4-dithiophene-2， 5-diol （B）， and phenyl acetate （D）. A kinetic model for the resolution was developed for the first time， which fits the experimental data very well. The transformation may follow a power law， and the enzymatic lactonization may follow a sequential mechanism with product inhibition. PR can be synthesized efficiently by the one-pot method， and the mechanism of the reaction is revealed by the kinetic model established.

Key words： kinetic model; lipase; hemithioacetal conversion; 1， 3-oxathiolane; Enzymatic synthesis