竹葉多糖提取分離及體外抗氧化自由基的研究*

周先泰，陳 蓉，齊 娜,2

(1 桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541000；2 南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510315)

竹子為禾本科(Gramineae)植物[1]，廣泛分布于亞非大陸、南北美洲及太平諸島地區(qū)，我國竹林資源占世界竹林資源的3%[2]。其中竹葉(Bamboo)在我國作為傳統(tǒng)中藥材，2015年版藥典一部記載其功效為清熱除煩、生津、利尿的功效[3]。當(dāng)代藥理學(xué)研究同樣表明多糖具有廣泛的藥理作用，諸如抗腫瘤、降血糖[6]、增加機(jī)體免疫力[7]和抗心肌缺血[8]等作用，以及抗菌抗病毒和抗氧化作用。

目前針對竹葉多糖方面的研究僅有少量的工藝提取與活性研究，針對竹葉多糖抗氧化研究較少。本研究旨在使用水提醇沉法制[14]取竹葉粗多糖，并進(jìn)一步對粗多糖進(jìn)行純化，探索水提醇沉法對竹葉多糖的提取率以及純化多糖的產(chǎn)率。并探索竹葉多糖對DPPH自由基以及超氧自由基的清除效果，對竹葉多糖的提取及抗氧化活性進(jìn)行初步探索。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

1.1.1 原 料

竹葉，購買于桂林市吉爾康大藥店，經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室藍(lán)倫禮老師鑒定為禾本科植物淡竹的干燥葉。

1.1.2 試 劑

95%乙醇(AR，批號：1712172)，購于西隴科學(xué)股份有限公司；葡萄糖(AR，批號：1605241)，購于汕頭市西隴化工廠有限公司；抗壞血栓(AR，批號：1101051)，購于西隴化工股份有限公司；濃硫酸(AR，批號：1708251)，購于西隴科學(xué)股份有限公司；DPPH(AR)，購于阜陽曼林生物技術(shù)有限公司；鄰苯三酚(AR)、氯仿(AR，批號：1801032)，購于西隴科學(xué)股份有限公司；正丁醇(AR)，購于西隴化工服務(wù)有限公司；Tris(批號：F20090225)，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸(AR)，購于西隴化工股份有限公司；丙酮(AR，批號：20100920)，購于衡陽市凱信化工制劑有限公司；乙醚(AR，批號：170417)，購于四川西隴化工有限公司；D101大孔樹脂、a-萘酚，購于中國上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站。

1.1.3 儀 器

BT224S電子天平，Sartorius；UV-1600PC紫外分光光度計(jì)，Mapada；KQ5200DA超聲清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予化制造廠；XW-80A渦旋混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DZF-6050真空干燥機(jī)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 多糖樣品制備

竹葉70 ℃蒸餾水浸泡30 min，料液比1:10，超聲浸提20 min/次，浸提3次，合并濾液，70 ℃旋蒸濃縮至1:1(1 g竹葉1 mL)，冷卻后加3倍95%乙醇4 ℃沉淀12～24 h， 3000 r/min離心10 min，沉淀物分別用少量無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌后， 40 ℃真空干燥后，得粗多糖稱重。得到的粗多糖用Sevag法脫蛋白，隨后使用D101大孔樹脂純化[15]，流速1.0 mL/min，純水洗脫，待洗脫液無Molish反應(yīng)[16]停止洗脫70 ℃旋蒸濃縮后烘干，4 ℃密封保存樣液。

1.2.2 多糖樣品含量測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：采取苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，490 nm[12]處測吸光度A值，以 A 值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)(mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：

C=aA+b

標(biāo)準(zhǔn)曲線中的方法，以樣液為參比液，測溶液吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中葡萄糖含量：

多糖含量=CD/W×100%

式中：C為樣品中葡萄糖的含量(μg/mL)；D為樣品稀釋倍數(shù)；W為粉末樣品質(zhì)量。

1.2.3 多糖抗DPPH自由基效應(yīng)測定

表1 DPPH溶液濃度Table 1 DPPH solution concentration

DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：采取DPPH法測多糖抗氧化活性，取1×10-4mol·L-1DPPH溶液，0.13 mg/mL多糖溶液和0.2 mg/mL抗壞血栓溶液，分光光度計(jì)在190～800 nm波長處進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長λmax。

DPPH溶液的配制見表1。避光靜置15 min，50%乙醇空白對照，在DPPH最大吸收波長下，以DPPH濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)曲。

配置2.0 mL 0.1 mg/mL的 DPPH溶液，分別加入1 mL不同濃度的竹葉多糖溶液或維生素C(Vc)溶液，混勻， 50%乙醇加至4.0 mL; 空白管中為同濃度多糖樣品液，加50%乙醇至4.0 mL，搖勻，避光靜置15 min后， 50%乙醇6 mL和2 mL蒸餾水混合調(diào)零，依據(jù)1.2.4最大吸收波長處測定吸光度，所有數(shù)據(jù)重復(fù)測定三次取均值。

樣品對DPPH清除率=1-[(樣品吸光度-空白吸光度)/0.2 mg DPPH 標(biāo)準(zhǔn)品吸光度]×100 %

1.2.4 多糖抗超氧陰離子效應(yīng)測定

采取鄰苯三酚法測定抗超氧陰離子效應(yīng)，鄰苯三酚自氧化吸光度測定： 4.2 mL蒸餾水和pH 8.2的4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液，25 ℃水浴20 min,立即加入0.5 mL同條件預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚, 325 nm每30 s測吸光度, 測定4 min。pH 8.2的4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液、4.2 mL蒸餾水和0.5 mL 10 mmol/L HCl做空白調(diào)零。

式中：ΔA1/Δt 為鄰苯三酚自氧化時(shí)的反應(yīng)速率；ΔA2/Δt 為加入多糖樣品液后鄰苯三酚自氧化時(shí)的反應(yīng)速率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(X±SD)表示，數(shù)據(jù)用Excel軟件及Origin 8.5軟件進(jìn)行整理分析，采用Excel進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖樣品含量測定

在490 nm波長處吸光度(A)對葡萄糖濃度(C)做線性回歸方程為y=8.0263x-0.0116，相關(guān)系數(shù)R2=0.9911。在0.02～0.1 mg/mL濃度內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。方程中Y為吸光度，X為多糖濃度(mg/mL)。

取提取后多糖粉末溶解于2 mL水中，平行測定三次，取吸光度平均值計(jì)算多糖濃度C，按標(biāo)曲方程計(jì)算多糖含量。結(jié)果見表2，竹葉粗多糖含量為0.525%，脫蛋白之后多糖含量為0.327%，粗多糖中蛋白含量占粗多糖的37.71%。

表2 多糖百分含量(n=3)Table 2 The percentage of polysaccharides(n=3)

2.2 多糖抗DPPH自由基效應(yīng)測定

圖1從左到右分別為DPPH溶液、多糖溶液和Vc溶液全波長掃描，由圖1可知，DPPH在525 nm有最大吸收且多糖與維生素C在該波長處無干擾，取525 nm作為DPPH檢測波長。

在525 nm下測定的吸光度(A)對DPPH濃度(C)做線性回歸：DPPH回歸曲線方程為y=0.2083.6x+0.0407，相關(guān)系數(shù)R2=0.9917。方程中Y為吸光度，X為DPPH濃度，單位：mg/mL。

圖1 DPPH(A)、多糖(B)、Vc(C)全波長掃描Fig.1 DPPH(A),polysaccharide(B),Vc(C)full wavelength scanning

粗多糖測定的0.2 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)管A為0.430；0.430；0.0478。Vc測定0.2 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)管A 為0.478；0.500；0.500。

表3 粗多糖清除DPPH吸光度測定Table 3 The determination of DPPH absorbance by crude polysaccharide

表4 維生素C清除DPPH吸光度測定Table 4 The determination of DPPH absorbance by vitamin C

將上述A值代入DPPH清除率計(jì)算公式?？芍侄嗵请S濃度增加，對DPPH的清除率增大，在0.429 mg/mL到0.66 mg/mL時(shí)，清除率增加不大。濃度達(dá)1.08 mg/mL，清除率下降。維生素C隨著濃度增加，對DPPH的清除率增大，濃度達(dá)0.0541 mg/mL，清除率下降。粗多糖有較好的清除DPPH的能力，維生素C對DPPH的清除率強(qiáng)于粗多糖。計(jì)算結(jié)果如表5和表6所示。

表5 粗多糖清除DPPH清除率計(jì)算Table 5 The removal rate of DPPH was calculated by using crude polysaccharide

表6 維生素C清除DPPH清除率計(jì)算Table 6 Vitamin C clears DPPH clearance rate

2.3 多糖抗超氧陰離子效應(yīng)

鄰苯三酚自氧化速率經(jīng)紫外分光光度計(jì)測量數(shù)據(jù)如表7所示。由表7可知鄰苯三酚自氧化速率(ΔA1/Δt)=0.00437(ΔA1/Δt：每隔30 s吸光度的差值與時(shí)間之比)。

表7 鄰苯三酚自氧化吸光度Table 7 Autoxidation absorbance of Pyrogallol

表8 0.107 mg/mL粗多糖濃度管自氧化吸光度Table 8 Autoxidation absorbance of 0.107 mg/mL crude polysaccharide concentration tube

分別用1 mL 0.107、0.2、0.301 mg/mL濃度的粗多糖溶液根據(jù)1.2.4多糖抗鄰苯三酚的測定方法，在4 min內(nèi)每隔30 s測定吸光度，每個(gè)粗多糖濃度平行測定三次。測定結(jié)果見表8、表9、表10。將表8、表9、表10中數(shù)值代入1.2.4公式中計(jì)算得粗糖溶度在0.107～0.301 mg/mL溶度范圍內(nèi)，對鄰苯三酚的清除率也隨之上升，結(jié)果見表11。

表9 0.2 mg/mL粗多糖濃度管自氧化吸光度Table 9 Autoxidation absorbance of 0.2 mg/mL crude polysaccharide concentration tube

表10 0.301 mg/mL粗多糖濃度管自氧化吸光度Table 10 Autoxidation absorbance of 0.301 mg/mL crude polysaccharide concentration tube

表11 不同濃度多糖對鄰苯三酚的清除率Table 11 The clearance rate of pyrogallol in different concentration of polysaccharide

3 討 論

近年來，天然植物多糖的相關(guān)研究備受關(guān)注，不僅局限于我國，國外研究者們也逐漸聚焦于此，但目前為止，研究者們對于竹葉多糖的抗氧化研究較少，本研究利用水提醇沉法提取竹葉多糖，同時(shí)采取Sevag以及D101大孔吸附樹脂對粗多糖進(jìn)行精制，研究粗多糖在竹葉中的含量，以及粗多糖中蛋白含量和精制后多糖的產(chǎn)率。結(jié)果表明竹葉中粗多糖含量為0.525%，多糖中蛋白含量為粗多糖的37.71%。

人體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與細(xì)胞衰老關(guān)系密切[20]，也與不少疾病有直接相關(guān)性，例如：帕金森綜合征[21]、阿爾茨海默癥[22]、糖尿病[6]等。通常情況機(jī)體內(nèi)存在諸如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)以及過氧化氫酶(Catalase,CAT)等內(nèi)源性抗氧化劑以抑制活性氧自由基，正常生理狀況下自由基產(chǎn)生以及內(nèi)源性過氧化物酶之間的清除率處于動態(tài)平衡中。當(dāng)自身內(nèi)源性抗氧化物酶清除率不及活性氧產(chǎn)生率時(shí)，則需要外源性抗氧化劑，以避免體內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞,對于外源性抗氧化劑，不少研究證實(shí)天然植物多糖對生物體而言是較為安全的抗氧化劑。竹葉粗多糖在體外對DPPH的清除率以及多糖抗超氧陰離子效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明竹葉多糖具有明顯的抗氧化活性。

4 結(jié) 論

竹葉中提取的多糖具有顯著的體外抗氧化活性，對抗氧化物質(zhì)而言有潛力運(yùn)用于帕金森綜合征、阿爾茨海默癥、糖尿病等由體內(nèi)活性氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激引發(fā)身體損傷的疾病治療性藥物或保健食品的開發(fā)。由于竹葉資源在我國產(chǎn)量巨大且價(jià)格低廉，若竹葉多糖提取分離技術(shù)及相關(guān)生物活性等相關(guān)技術(shù)研究進(jìn)一步成熟，可豐富竹葉保健用食品及藥品品種，產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)利益。