殼寡糖抑菌性能的研究

趙 倩，謝全喜，徐海燕，谷 巍，曹 斌，鄭軍紅

（山東寶來利來生物工程股份有限公司山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東泰安 271000）

殼聚糖是一種廣泛存在于自然界中，由蝦、蟹、昆蟲的幾丁質(zhì)外殼經(jīng)過不同程度地脫乙?；玫降囊环N無毒聚氨基葡萄糖[1]。殼寡糖（β-1,4-寡糖-葡萄糖胺）是殼聚糖經(jīng)物理、化學(xué)或特殊的生物酶降解得到的一種聚合度在2～20之間的寡糖產(chǎn)品，其水溶性好、功能作用大和生物活性高[2]。殼寡糖是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基寡糖，綠色天然、無副作用，已經(jīng)成為國際上新興的功能性低聚糖。殼寡糖由于易于吸收，功效顯著，已經(jīng)作為生物保鮮劑[3-4]和飼料添加劑[5]廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域等，主要用于降血脂、抗癌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等[6]。

楊煥蝶等[7]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對大腸桿菌（Escherichia coli）具有較好的抑菌作用，且較低的乙酰度和pH值更有利于殼聚糖發(fā)揮其抑菌活性。錢建瑛等[8]研究發(fā)現(xiàn)，降低pH值、提高脫乙酰度和提高殼寡糖溶液濃度等能夠提高殼寡糖的抑菌活性。目前，殼寡糖作為功能性低聚糖也被廣泛應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖中，研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖能夠增殖有益菌，抑制有害菌生長，調(diào)節(jié)機體腸道微生態(tài)平衡。殼寡糖的抗菌性能是光譜性的，已有不少學(xué)者對其抑菌抗菌[9]、抗病毒[10]和抗腫瘤[11]等進行了研究。馮文娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對大腸桿菌、白色念珠菌（Candida albicans）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有良好的抑菌活性，對大腸桿菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）均為6.5 g/L；對枯草芽孢桿菌的MIC和MBC均為1.5 g/L；錢建瑛等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度＞5 mg/mL之后，抑菌效果與同質(zhì)量濃度苯甲酸鈉相近，降低pH值、提高脫乙酰度、提高殼寡糖溶液質(zhì)量濃度等都能提高殼寡糖的抑菌活性。目前，隨著國家對抗生素的使用要求越來越嚴(yán)格以及環(huán)保的壓力，在畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域，殼寡糖作為一種天然的免疫增強和炎癥調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，在增強動物免疫機能和抗炎方面具有較高的價值和應(yīng)用前景[1]。

本研究采用牛津杯法和共培養(yǎng)法研究殼寡糖對雞源、豬源大腸桿菌和沙門氏菌（Salmonella）的抑菌作用以及殼寡糖對乳酸菌生長的影響，以期為開發(fā)殼寡糖和乳酸菌復(fù)合產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

殼寡糖（聚合度2～10，分子質(zhì)量≤2 000 Da，純度為80%）：山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（xylose lysine deoxycholate，XLD）瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 菌株

病原菌（雞源大腸桿菌菌株BLCC8-0102、雞源沙門氏菌菌株BLCC8-0104、豬源大腸桿菌菌株BLCC8-0001和豬源沙門氏菌菌株BLCC8-0063）：從患病畜禽病料中分離、鑒定，保存于本實驗室；乳酸菌菌株BLCC2-0015和BLCC2-0126：山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；SW-CJ-2F（2）超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：常州諾基儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛津杯法測定殼寡糖對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

分別將大腸桿菌和沙門氏菌以無菌操作稀釋一定倍數(shù)，取0.1 mL均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，放入牛津杯，每個杯中分別注入質(zhì)量濃度為0.02 g/mL、0.10 g/mL、0.20 g/mL和0.50 g/mL的殼寡糖溶液0.2 mL，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，設(shè)置營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為陰性對照[13]。

藥敏試驗判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)抑菌圈直徑＞15 mm時為高敏；介于10～15 mm之間時為中敏；＜10 mm時為低敏[14]。

1.3.2 共培養(yǎng)法檢測殼寡糖對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

病原菌菌液的制備：從斜面挑取1環(huán)病原菌菌苔接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/250 mL，于37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0（空白組）、0.02 g/mL、0.10 g/mL、0.20 g/mL和0.50 g/mL的殼寡糖，同時按1%（V/V）的接種量接入培養(yǎng)好的病原菌菌液，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別于2 h和8 h取樣檢測病原菌活菌數(shù)，大腸桿菌接種于伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h進行菌落計數(shù)；沙門氏菌接種于XLD培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h進行菌落計數(shù)。大腸桿菌按照GB/T 18869—2002《飼料中大腸菌群的測定》進行菌落計數(shù)；沙門氏菌按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》進行菌落計數(shù)。

1.3.3 殼寡糖對乳酸菌的抑菌作用

乳酸菌菌液的制備：從斜面上挑取1環(huán)乳酸菌菌苔接種到MRS肉湯培養(yǎng)基，裝液量為250 mL/250 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，備用。

在MRS肉湯培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為0（空白組）、0.2 g/mL和1.0 g/mL的殼寡糖，同時按照2%（V/V）的接種量接入上述準(zhǔn)備好的乳酸菌菌液，于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h和24 h時取樣檢測乳酸菌活菌數(shù)，檢測方法按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》進行。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2013軟件進行初步處理后，采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA進行方差分析，最小顯著差異（least significant difference，LSD）法進行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

2.1.1 牛津杯法檢測殼寡糖對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

采用牛津杯法檢測殼寡糖對雞源和豬源大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用，均未檢測到抑菌圈。

2.1.2 共培養(yǎng)法檢測殼寡糖對雞源大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

沙門氏菌和大腸桿菌是兩種重要的人畜共患病致病菌，嚴(yán)重威脅畜禽健康、食品安全、人類健康和公共安全。大腸桿菌普遍存在于人類和畜禽腸道內(nèi)，大部分血清型作為腸道內(nèi)的共生菌是沒有毒性的，僅少數(shù)血清型的大腸桿菌具有致病性，可引起嚴(yán)重的腸道感染，給畜禽業(yè)造成嚴(yán)重損失[15]。我國沙門氏菌有290多種血清型，不同血清型的沙門氏菌的致病性存在差異，能夠引起傷寒、副傷寒以及胃腸道疾病等。我國每年因沙門氏菌食物中毒的發(fā)病人數(shù)達300萬人次，其中近半數(shù)與生雞肉交叉污染有關(guān)[16]。殼寡糖具有良好的藥理學(xué)作用和安全性以及多種有益的生物學(xué)活性，其中對炎性信號傳導(dǎo)通路的抑制被認(rèn)為是其發(fā)揮抗炎作用的主要機制[1]。采用共培養(yǎng)法檢測殼寡糖對雞源大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用，結(jié)果見表1。

表1 殼寡糖對雞源大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用Table 1 Inhibition of oligochitosan on Escherichia coli and Salmonella from chicken

由表1可知，殼寡糖對雞源大腸桿菌的抑制作用：培養(yǎng)2 h時，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質(zhì)量濃度外，大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；培養(yǎng)8 h時，與空白組相比，4個殼寡糖組大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強。殼寡糖對雞源沙門氏菌的抑制作用：培養(yǎng)2 h時，與空白組相比，4個殼寡糖組沙門氏菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強；培養(yǎng)8 h時，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質(zhì)量濃度外，沙門氏菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)，在固體培養(yǎng)基中進行殼寡糖的抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等有害菌具有抑制作用[17]。本試驗結(jié)果與已有研究一致，殼寡糖在抑制大腸桿菌和沙門氏菌方面效果顯著，具有抗炎作用。

2.1.3 共培養(yǎng)法檢測殼寡糖對豬源大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

表2 殼寡糖對豬源大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用Table 2 Inhibition of oligochitosan on Escherichia coli and Salmonella from pig

由表2可知，殼寡糖對豬源大腸桿菌的抑制作用：培養(yǎng)2 h時，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質(zhì)量濃度外，大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；培養(yǎng)8 h時，與空白組相比，4個殼寡糖組大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。殼寡糖對豬源沙門氏菌的抑制作用：培養(yǎng)2 h時，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質(zhì)量濃度外，沙門氏菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；培養(yǎng)8 h時，與空白組相比，4個殼寡糖組大腸桿菌活菌數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強。

2.2 殼寡糖對乳酸菌的抑制作用

大量研究表明，殼寡糖能夠改善動物腸道微生態(tài)環(huán)境，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，促進動物生長[18]。乳酸菌在調(diào)節(jié)免疫功能方面的機制尚不完全清楚，但其具有與有害菌競爭性排斥、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能[19]。目前，關(guān)于殼寡糖對乳酸菌抑制作用的報道較少，祁東風(fēng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖可抑制有害菌增殖，增加優(yōu)勢菌群含量。但紀(jì)小敏等[21]研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對保加利亞乳桿菌（Lactobacil-lus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的生長活性具有一定的抑制作用。本試驗通過共培養(yǎng)法檢測殼寡糖對乳酸菌的抑制作用，結(jié)果見表3。

表3 殼寡糖對乳酸菌活菌數(shù)的影響Table 3 Effect of oligochitosan on the viable lactic acid bacteria count

由表3可知，殼寡糖對乳酸菌BLCC2-0015的抑制作用：培養(yǎng)8 h時，與空白組相比，殼寡糖的添加，使得乳酸菌活菌數(shù)顯著降低（P＜0.05）；培養(yǎng)24 h時，與對照組相比，添加0.20 g/mL的殼寡糖對乳酸菌活菌數(shù)影響不顯著（P＞0.05），添加0.50g/mL的殼寡糖可顯著降低乳酸菌活菌數(shù)（P＜0.05）。殼寡糖對乳酸菌BLCC2-0126的抑制作用：培養(yǎng)8 h和24 h時，空白組相比，添加0.2 g/mL的殼寡糖對照乳酸菌活菌數(shù)影響不顯著（P＞0.05），添加0.50 g/mL的殼寡糖顯著降低乳酸菌活菌數(shù)（P＜0.05）。劉媛媛等[2]研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖能增加斷奶仔豬有益微生物數(shù)量。但也有研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加250 mg/kg的殼寡糖能降低回腸中乳酸桿菌和大腸桿菌數(shù)量，顯著降低乳酸濃度[22]。本研究中0.5 g/mL的殼寡糖對乳酸菌具有抑制作用，0.2 g/mL的殼寡糖與乳酸菌共培養(yǎng)24 h時對乳酸菌活菌數(shù)沒有影響，不具備抑制作用，說明0.2 g/mL的殼寡糖與乳酸菌可以共同使用，不會產(chǎn)生抑制作用。

3 結(jié)論

牛津杯法未檢測出殼寡糖對病原菌的抑制作用；共培養(yǎng)法證實質(zhì)量濃度為0.1 g/mL、0.2 g/mL和0.5 g/mL的殼寡糖對雞源、豬源大腸桿菌和沙門氏菌均具有顯著的抑菌作用（P＜0.05），且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強；0.2 g/mL殼寡糖與乳酸菌共培養(yǎng)24 h對乳酸菌活菌數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。