合成微生物群落及在發(fā)酵食品中應(yīng)用研究進(jìn)展

張小龍，王嘉瑞，李青卓，付彩霞，汪 超，徐 寧*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430068；2.湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北宜昌 443000）

微生物作為地球上蘊(yùn)含量巨大且最具發(fā)展?jié)摿Φ纳镔Y源，近年來隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，人們對微生物的分析在不斷增加。在早期的生物學(xué)研究中，研究者的目光主要集中在微生物單群體，其作為微生物群落中的關(guān)鍵功能群體將其分離、改造，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)功能的加強(qiáng)[1]。然而人們忽視了微生物并不是單獨(dú)存在的，而是處于復(fù)雜的、動態(tài)的群落中，正是它們的相互作用推動了群落的穩(wěn)定、功能與進(jìn)化[2]。近年來，隨著食品發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用需求的不斷提高，由于功能單一的菌種在提高風(fēng)味品質(zhì)方面存在著局限性，使得利用多種功能微生物組合來構(gòu)建合成微生物群落成了發(fā)酵食品領(lǐng)域中一個研究的熱點(diǎn)。所謂的合成微生物群落是指在明確培養(yǎng)基質(zhì)的條件下，人工將兩種或兩種以上遺傳背景完全解析的微生物通過共同培養(yǎng)而形成的微生物群體，其組成可以是自然界中不一定共存的野生型菌株也可以是一個或多個經(jīng)基因改造的工程菌株[3-4]。合成微生物群落實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)單一菌種行為研究向整個微生物群落行為研究的轉(zhuǎn)變。

合成微生物群落涉及的研究領(lǐng)域眾多，其最終目標(biāo)是利用單個微生物的個體能力以及微生物間的相互作用，對復(fù)雜的代謝任務(wù)進(jìn)行勞動分工、功能互補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)特定的功能，如提高種群的生產(chǎn)力、穩(wěn)定性、代謝功能等[5]。由于合成微生物群落中的微生物是可控性的，因此可以按功能導(dǎo)向性的需求對微生物進(jìn)行組裝，使微生物彼此配合發(fā)揮更大的作用。而中國傳統(tǒng)的食品釀造是一個典型多菌種參與的復(fù)雜過程，因此若能夠構(gòu)建出穩(wěn)定高效的發(fā)酵微生物群落將對提高發(fā)酵食品質(zhì)量有著重要的意義。該文將對合成微生物群落的特征、微生物間的相互作用和調(diào)控機(jī)制以及其近年來在發(fā)酵食品領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行概述，并對如何構(gòu)建穩(wěn)定、高效的發(fā)酵微生物群落進(jìn)行了展望，旨在為合成微生物群落在發(fā)酵食品行業(yè)的進(jìn)一步深入研究及開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 合成微生物群落的特征

與單菌種或自然群落相比，合成微生物群落具有以下特征：①相較于單菌種，微生物群落具有更廣泛的代謝靈活性，通過物種間交流能夠更有效地催化許多復(fù)雜過程，執(zhí)行對單個菌株來說很難甚至是不可能完成的復(fù)雜任務(wù)[6-7]；②與自然微生物群落相比，合成微生物群落往往更傾向于生態(tài)理論的研究，因?yàn)楹铣傻奈⑸锶郝渲械奈锓N是已知的，具有明確的遺傳特性，且復(fù)雜性較低、可控性較強(qiáng)[4，8]；③與單菌種相比，群落中微生物物種豐富，可以將復(fù)雜的代謝途徑進(jìn)行劃分，通過成員間的勞動分工和資源交換可以降低細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)[9-10]；④由于遺傳存在著不穩(wěn)定性，對于單菌種來說生長環(huán)境的改變會對其產(chǎn)生干擾，使其產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物，而微生物群落中混合物種代謝模式多樣，且菌種間存在溝通和交流，使其比單一菌種具有更高的穩(wěn)定性，對待外界環(huán)境的擾動具有更高的抵抗性[11-12]；⑤合成微生物群落與自然微生物群落相比物種較少，且結(jié)構(gòu)簡單，可以從分子系統(tǒng)理論出發(fā)，通過網(wǎng)絡(luò)推理和元組數(shù)據(jù)的動態(tài)建模進(jìn)行描述，并且由此可以用來開發(fā)和驗(yàn)證更復(fù)雜的、系統(tǒng)的模型[13-14]。

2 合成微生物群落相互作用和調(diào)控機(jī)制研究

在自然界中，群落的的穩(wěn)定性通常是通過群落中微生物間的相互作用來調(diào)節(jié)，因此構(gòu)建微生物群落必須要考慮微生物間可能存在的相互作用形式，物種間相互作用形式一般分為：通過交叉喂養(yǎng)的方式進(jìn)行代謝相互作用，通過代謝物和自誘導(dǎo)信號分子的傳遞進(jìn)行種間相互作用，以及在環(huán)境的刺激下進(jìn)行種間相互作用，因此可以通過改變細(xì)胞交流、物種代謝作用、生長環(huán)境等方式對微生物間的相互作用進(jìn)行調(diào)控，從而對合成微生物群落進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)特定的功能。

2.1 微生物間的相互作用研究

自然界中大多數(shù)微生物并不是作為一個獨(dú)立的個體單獨(dú)存在的，而是作為一個復(fù)雜的、高度多樣化和高度動態(tài)化的微生物群落中的一部分而存在的，在群落中成員之間存在著相互交流和合作，通過成員間的相互作用來影響著群落的行為表現(xiàn)，進(jìn)而影響著群落的應(yīng)用[2]。群落中物種間的相互作用機(jī)制一直是生態(tài)學(xué)研究者熱點(diǎn)研究的領(lǐng)域，因?yàn)槲锓N間不同類型的相互作用不僅是影響微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的主要因素之一，同時也被認(rèn)為是影響生物多樣性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素之一[15]。在自然群落中，微生物與其他系統(tǒng)發(fā)育類群的微生物不斷相互作用，從而形成復(fù)雜的生態(tài)相互作用網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)研究物種間的相互作用可以分為積極的和消極的兩種類型，積極的相互作用包括共生（互利共生和偏利共生），消極的相互作用包括寄生、捕食以及競爭[16]。由于菌種間存在復(fù)雜的交互關(guān)系，因此在構(gòu)建微生物群落時要考慮參與菌種的功能、分布和生長環(huán)境等眾多因素，而不是將多種微生物進(jìn)行的隨機(jī)組合。

2.2 基于代謝作用對微生物間相互作用調(diào)控

在合成微生物群落中的微生物之間可以通過交換代謝物進(jìn)行交流，利用資源的共享實(shí)現(xiàn)微生物間的相互作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)在利用蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和泡囊短波單胞菌（Brevundimonas naejangsanensis）混菌發(fā)酵生產(chǎn)氫的過程中存在基于代謝物交換介導(dǎo)的相互作用。在發(fā)酵過程中蠟樣芽孢桿菌通過代謝作用能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為乳酸，其作為碳源和電子供體，為泡囊短波單胞菌的細(xì)胞生長和產(chǎn)氫提供支持；作為回報(bào)，泡囊短波單胞菌通過代謝產(chǎn)生甲酸鹽，作為電子載體穿梭到蠟樣芽孢桿菌并供其利用，促進(jìn)了氫的產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合菌株分別與兩株單菌種發(fā)酵相比，淀粉的利用率提高了14.7%和27.5%，氫的產(chǎn)量提高了42.3%和58.2%，從而有效的克服了單一菌株在代謝工程中存在的局限性[18]。此外，群落中的微生物還可以通過交換代謝中間物來影響彼此的活動，這些代謝中間物可以促進(jìn)或抑制對方的生長，實(shí)現(xiàn)物種間的相互作用，進(jìn)而協(xié)調(diào)整個群落的活動[19]。

2.3 基于細(xì)胞交流對微生物間相互作用調(diào)控

在微生物群落中，一些微生物之間存在的細(xì)胞交流是基于分泌特定的分子產(chǎn)生的，使得微生物之間存在著許多以不同小分子為依賴的相互作用[20]。目前研究最為普遍的細(xì)胞交流方式是基于群感效應(yīng)的專有信號分子的傳導(dǎo)，這些信號分子包括細(xì)胞產(chǎn)生的胞外酶、次級代謝物等，同時微生物還可以利用與新陳代謝和生長有關(guān)的化學(xué)物質(zhì)來建立細(xì)胞間的相互作用[21]。細(xì)菌能夠釋放信號小分子，當(dāng)信號小分子在周圍介質(zhì)中積累并達(dá)到一定濃度時可以與其他細(xì)菌進(jìn)行交流，通過群落變化來感知鄰近物種的存在，測量它們的細(xì)胞密度，調(diào)節(jié)它們的基因表達(dá)，協(xié)調(diào)它們的團(tuán)體行為，從而實(shí)現(xiàn)了特定的功能[8，22]。研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）與白色念珠菌（Candida albicans）之間存在著的相互作用是理解真菌和細(xì)菌如何通過群體感應(yīng)系統(tǒng)相互調(diào)節(jié)的重要模型。通過將銅綠假單胞菌和白色念珠菌共培養(yǎng)時，銅綠假單胞菌可以合成2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮和3-氧-十二烷-高絲氨酸-內(nèi)酯等小分子，從而構(gòu)成復(fù)雜的群體感應(yīng)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，銅綠假單胞菌可以附著在絲狀形式的白色念珠菌上，并合成許多包括苯亞胺、綠膿桿菌、溶血性磷脂酶等小分子，從而有效的抑制白色念珠菌產(chǎn)生有毒物質(zhì)，減少對人體的傷害[23]。

2.4 基于環(huán)境因素對微生物間相互作用調(diào)控

在微生物群落中，微生物的生長環(huán)境不僅影響著微生物的生長繁殖，同時還影響群落的物種組成，進(jìn)而影響著微生物間的相互作用。因此在構(gòu)建微生物群落時可以通過改變物種的生存環(huán)境，如改變?nèi)郝洵h(huán)境中的溫度、濕度、氧氣水平、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的可利用性以及環(huán)境中有毒化合物的存在與否等因素，來協(xié)調(diào)群落的物種組成，促進(jìn)物種間的相互作用，從而對合成微生物群落進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)特定的功能[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)在利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）混菌發(fā)酵面團(tuán)時可以通過控制氧氣的供應(yīng)來促進(jìn)釀酒酵母與舊金山乳桿菌之間的相互作用。在發(fā)酵過程中釀酒酵母可以通過代謝作用將糖類轉(zhuǎn)化為CO2，體系中大量CO2的生成為厭氧型乳酸菌舊金山乳桿菌提供呼吸保護(hù)，使其免受氧的抑制，從而有效的促進(jìn)了舊金山乳桿菌細(xì)胞的生長；同時舊金山乳桿菌通過代謝作用可將麥芽糖和蛋白質(zhì)水解為葡萄糖和氨基酸等物質(zhì)，以供釀酒酵母利用，混菌相互作用改變了面團(tuán)發(fā)酵體系中微生物的生長環(huán)境，促進(jìn)了二者的生長，使面團(tuán)的發(fā)酵時間對比單菌株縮短，面團(tuán)中氨基酸含量提高，這對面團(tuán)品質(zhì)的提高有著重要的意義[26-27]。

3 合成微生物群落的應(yīng)用

近年來，隨著科技的不斷發(fā)展和對單菌種研究的不斷增加，通過將理論與技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建出穩(wěn)定高效的微生物群落，使得合成微生物群落應(yīng)用不斷擴(kuò)展，其中包括發(fā)酵食品領(lǐng)域主要涉及醬油、白酒、食醋、酸奶等的生產(chǎn)應(yīng)用。

3.1 醬油生產(chǎn)應(yīng)用

微生物在醬油釀造的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，我國醬油生產(chǎn)多采用單一的米曲霉（Aspergillus oryzae）純種制曲，利用米曲霉制曲時分泌的各種酶來分解原料中的蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)并進(jìn)一步發(fā)酵而成[28]。單一米曲霉制曲時對所需原料要求相對簡單，對微生物的生長所需的參數(shù)易控制，但其代謝產(chǎn)物的種類和含量不豐富，導(dǎo)致產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)不足。很多研究者通過構(gòu)建多菌種的合成微生物群落制曲、發(fā)酵醬油，在制曲階段選育多種遺傳背景已知釀造微生物進(jìn)行混合制曲，通過微生物間的相互交流和互補(bǔ)，來提高醬油產(chǎn)品風(fēng)味和生物活性成分[29-30]。如PENG M Y等[31]研究發(fā)現(xiàn)，通過將米曲霉和黑曲霉（Aspergillus niger）混合制曲能夠提高蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活力，增加了原料中蛋白質(zhì)和淀粉的水解效果，同時在總酚含量、總黃酮含量、三種異黃酮苷元（大豆苷元、糖苷元、染料木素）和抗氧化活性方面，混菌發(fā)酵均高于純種制曲發(fā)酵，這對提高醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要作用。

3.2 白酒生產(chǎn)應(yīng)用

傳統(tǒng)白酒的釀造屬于典型的自然發(fā)酵，發(fā)酵體系中存在著以酵母為主的復(fù)雜微生物結(jié)構(gòu)，然后通過這些微生物的生物轉(zhuǎn)化完成了白酒的釀造。根據(jù)酵母在釀酒中的作用，可將酵母分為釀酒酵母和非釀酒酵母兩大類。釀酒酵母具有較高的發(fā)酵速率和發(fā)酵能力，在白酒釀造中主要完成酒精的發(fā)酵，同時通過代謝作用能夠產(chǎn)生高級醇類、酯類、有機(jī)酸等多種揮發(fā)性物質(zhì)[32]。相對于釀酒酵母，非釀酒酵母雖然發(fā)酵能力較低，但具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，能夠?qū)⒃现械那绑w物質(zhì)經(jīng)過一系列生化反應(yīng)形成酸、酯、醛和高級醇等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，同時這些菌在白酒發(fā)酵過程中還能有效抑制一些腐敗菌的繁殖，這對提高白酒的品質(zhì)有著重要作用[33-34]。隨著白酒市場的不斷擴(kuò)大，人們對白酒品質(zhì)的要求也更加嚴(yán)格，所以由傳統(tǒng)的單一菌種釀造向混菌釀造方面成為了研究熱點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)與酵母單獨(dú)釀造相比，酵母混菌發(fā)酵出的白酒風(fēng)味物質(zhì)更加豐富[35-36]。如ZHA M S等[37]利用釀酒酵母和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）混菌發(fā)酵釀造白酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵提高了酵母的細(xì)胞代謝活性，促進(jìn)了發(fā)酵液中乙醇和乙酸乙酯的生成，從而有效改善了發(fā)酵液的風(fēng)味特性，提高了白酒的品質(zhì)。

3.3 食醋生產(chǎn)應(yīng)用

食醋在釀造過程中由于原料和曲中微生物的自發(fā)富集形成了復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)，不同地區(qū)由于食醋群落結(jié)構(gòu)的差異造成了食醋風(fēng)味的差異。隨著對食醋中微生物群落研究的深入，利用合成功能菌群來增強(qiáng)食醋中的風(fēng)味特征和功能物質(zhì)已獲得突破[38]。乙偶姻是食醋的一種重要風(fēng)味物質(zhì)，也是食醋中活性成分川芎嗪的前體之一，其含量對食醋品質(zhì)有著重要的影響[39]。為了提高食醋中乙偶姻的含量，可以通過向食醋中直接添加食品級的乙偶姻或者利用內(nèi)源性微生物強(qiáng)化兩種方法。而目前市面上銷售的食品級乙偶姻多是通過化學(xué)方法合成不僅價格昂貴，而且直接添加也可能會因?yàn)榛瘜W(xué)物質(zhì)的引入而影響食醋的安全性，因此采用內(nèi)源性微生物強(qiáng)化的方法來提高乙偶姻的產(chǎn)量成為了研究熱點(diǎn)，相較于前一種方法，這種方法不僅降低了乙偶姻的生產(chǎn)成本，而且更加健康安全[40-41]。已有研究揭示了巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianum）和5種乳酸菌（（短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、布氏乳桿菌（Lactobacillus brucei）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum））是合成乙偶姻相關(guān)的功能菌[42-43]。邱婷[44]以這6株功能菌株為研究對象，分別利用這幾種乳酸菌和醋桿菌進(jìn)行混菌發(fā)酵合成乙偶姻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單菌種發(fā)酵相比干酪乳桿菌和巴氏醋桿菌構(gòu)成混菌體系可顯著提高乙偶姻含量，同時促進(jìn)了酯類物質(zhì)的積累，這為傳統(tǒng)食醋中乙偶姻的強(qiáng)化生產(chǎn)指明方向，對提高食醋的品質(zhì)有著重要的意義。

3.4 酸奶生產(chǎn)應(yīng)用

由于傳統(tǒng)的酸奶發(fā)酵過程開放程度高，容易滋生和感染各種雜菌，導(dǎo)致其發(fā)酵產(chǎn)物不穩(wěn)定，影響了酸奶的品質(zhì)。因此有研究者提出通過從優(yōu)質(zhì)酸奶中分離出其中的功能菌群并加以利用，來提高酸奶的品質(zhì)[45-46]。酸奶中的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于微生物對原料中乳糖、蛋白質(zhì)的分解代謝，已有研究發(fā)現(xiàn)與單一的發(fā)酵劑相比，利用混菌作為發(fā)酵劑可有效改善酸奶的風(fēng)味特性，提高酸奶的品質(zhì)[47]。目前商業(yè)生產(chǎn)酸奶一般采用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）混菌作為發(fā)酵劑，通過兩種菌的協(xié)同作用加快了酸奶的酸化速率，提高了酸奶中芳香化合物的含量，增強(qiáng)了酸奶的營養(yǎng)價值[48]。隨著對酸奶中益生菌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)胃酸和膽汁對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌具有較強(qiáng)的殺傷作用，使其無法在腸道內(nèi)定植，從而使其有益作用受到了極大限制[49]。研究者通過模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）具有較強(qiáng)的胃酸和膽汁鹽耐受性，可在腸道內(nèi)大量存活，且嗜酸乳桿菌還具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力，適用于酸奶的發(fā)酵[50-51]。如李子葉等[52-53]以牛奶作為發(fā)酵基質(zhì)，利用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）混菌發(fā)酵酸奶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未加嗜酸乳桿菌的發(fā)酵組相比其產(chǎn)酸速率更快，酸奶中的活菌數(shù)更多，乙醛等風(fēng)味物質(zhì)含量更高，同時嗜酸乳桿菌還具有降低膽固醇含量、增強(qiáng)人體免疫力的作用，這對酸奶的益生功能的進(jìn)一步增強(qiáng)有著重要的意義。

4 總結(jié)和展望

合成的微生物群落不僅可控性高、穩(wěn)定性好，而且還能夠通過微生物之間的相互作用執(zhí)行單一菌株難以完成的復(fù)雜任務(wù)，使其成了發(fā)酵食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品屬于典型的自然發(fā)酵，發(fā)酵過程中由于開放程度較高，使得發(fā)酵體系中微生物構(gòu)成復(fù)雜，因此發(fā)酵完成不僅僅取決于單個微生物作用的疊加，還依賴著微生物間復(fù)雜的交互作用。現(xiàn)階段對食品發(fā)酵微生物種群的作用關(guān)系和代謝網(wǎng)絡(luò)的研究較少，想要調(diào)控微生物群落的發(fā)酵功能必須了解參與各種發(fā)酵生化反應(yīng)的微生物，通過代謝網(wǎng)絡(luò)模塊化處理將發(fā)酵任務(wù)分解，確定關(guān)鍵微生物的單元任務(wù)，并通過調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)和強(qiáng)化菌株功能來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)微生物群落的代謝功能的目標(biāo)。今后隨著對于食品微生物群落的組成、功能和相互作用的深入研究，借助合成微生物群落的理論和研究方法，設(shè)計(jì)和構(gòu)建出穩(wěn)定高效的靶向精準(zhǔn)的合成食品發(fā)酵微生物群落，將對我國發(fā)酵食品發(fā)展進(jìn)步有著重要意義。