基于VNTR技術的食用紅甜菜不育系的選育

張 琛，羅成飛，程大友

(1.哈爾濱工業(yè)大學 化工與化學學院; 2.哈爾濱師范大學)

0 前言

甜菜是重要的糖料作物，在我國東北、西北、華北具有較大的種植面積。甜菜雜種優(yōu)勢明顯，但其花器相對較小，且無限開花，在實際生產(chǎn)中，使用大規(guī)模的人工去雄方法是不現(xiàn)實的，若雜交母本具有雄性不育性，不但可以免去人工去雄的麻煩，而且也不會對F1代產(chǎn)生干擾，保持性狀穩(wěn)定[2]，雄性不育植物提供了利用雜種優(yōu)勢重要的育種工具，也提供了研究雜交作物的重要材料。所以自Owen于1945年發(fā)現(xiàn)甜菜雄性不育性之后，甜菜雜交種利用便逐漸成為甜菜雨中的主流技術。目前大多數(shù)甜菜雜交品種，都是利用細胞質(zhì)雄性不育(CMS)材料培育而成。迄今為止我國食用甜菜優(yōu)勢育種研究工作尚未開展，目前。

1 材料與方法

1.1 本研究所用實驗品種為

來自一年生哈爾濱工業(yè)大學自育食用紅甜菜品系“食甜一品紅”。對照品種為已知育性的自育甜菜系DY5-O(保持系)和DY5-CMS(不育系)，其中CMS系是多次與O型系回交產(chǎn)生的較為穩(wěn)定的CMS系。

1.2 主要試劑及配制

(1)甜菜幼葉DNA提取實驗試劑：CTAB提取緩沖液：CTAB 4 g， NaCl 16.364 g， 0.5M EDTA 8 ml， 1MTris-HCl 20 ml，用70 ml ddH2O先進行溶解， 再定容至200 ml，調(diào)節(jié)至pH8.0，滅菌，備用。巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇均為分析純。

(2)瓊脂糖凝膠電泳實驗試劑：TAE電泳緩沖液50×：Tris堿242 g，冰醋酸57.1 mL，0.5 mol/L NaZEDTA 100 mL， 加水至1 L調(diào)節(jié)至pH 8.0，使用時稀釋為1×TAE。DL15000 Marker、DL2000 Marker(天根試劑公司)，EtBr染料(寶泰克生物科技有限公司)，上樣緩沖液(北京鼎國昌盛公司)，瓊脂糖(Gene Tech公司)。

(3)酶及其他試劑。

表1 酶及其他試劑

(4)花粉TTC染色液：準確稱取0.5 g 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，溶于水中，轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容至100 ml.pH7±0.5。配置成0.5%TTC溶液。

1.3 甜菜幼苗的培育及春化處理

1.3.1 甜菜幼苗的培育

首先選取需要進行育性鑒定的甜菜種子，甜菜種子外殼厚，一般播種前先在水中浸泡12-24小時，使其更容易出苗，采用紙筒育苗技術，將浸泡過的種子播種，澆適量的水，置于培養(yǎng)溫室，大概一周以后，就可以長出幼苗，將其移入塑料盆，當甜菜長出4-6片真葉的時候，就可以對其進行春化處理。

1.3.2 甜菜的春化處理

將鑒定后被確認為不育系或保持系的甜菜母根在10月份甜菜收獲后，將甜菜母根放入3～5℃的窖中保存，在第二年4月15日前后將保持系母根與不育系母根中一起進行采種?；ㄆ谶M行育性觀察。

2 結果與分析

2.1 細胞質(zhì)育性多態(tài)性

依據(jù)不同細胞質(zhì)基因型的甜菜材料，其線粒體小衛(wèi)星的多態(tài)性，對200株一年生甜菜的細胞質(zhì)基因型進行鑒定，結果見表2。從表2可以看出，N1型細胞質(zhì)98株，該類型約占49%；而S細胞質(zhì)102株，占51%.說明該材料適合選育甜菜不育系和保持系。

表2 食用甜菜一品紅細胞質(zhì)及細胞核育性基因型分子檢測結果

2.2 細胞核育性多態(tài)性

依據(jù)甜菜細胞核基因bvORF17-上游區(qū)域的多態(tài)性，對食用甜菜一品紅品系的細胞核基因型的鑒定，發(fā)現(xiàn)食用甜菜一品紅品系細胞核的T1T2基因位點3.3比例最高，達到了56%，其次是3.5型，達到了39%。而與經(jīng)典遺傳學中的保持系核基因型相同的‘xxzz’型隱形純合基因型rf1rf1型選育出了11株。根據(jù)前人研究結果，我們指導該細胞核育性基因位點為T1T2。即T1T2基因位點為4.4型。

圖1 不同細胞核類型所占比例

2.3 育性分子多態(tài)性

食甜一品紅細胞質(zhì)及細胞核的分子育性多態(tài)性分布情況如圖2。Ow-4.4型占。該基因類型約占5.5%。這個比列與采用傳統(tǒng)方法選育保持系的比列相近。

圖2 不同細胞質(zhì)與細胞核互作類型及比例

2.4 花期田間鑒定

對選育出Ow4,4型單株母根進行春化處理,春季栽植到田間進行花期育性鑒定。發(fā)現(xiàn)者11株的花藥顏色多為褐色，個別白色?；ㄋ幓静婚_裂。幾乎沒有花粉粒，用TTC法染色也均無色，表現(xiàn)出較好的不育性。而與其栽植在一起的保持系植株的花藥則表現(xiàn)出花藥黃素，花粉粒飽滿，用TTC法染色該花粉呈現(xiàn)紅色，說明其花粉有活力育性很好。

3 討論

3.1 該材料是比較理想的被鑒定品系。細胞質(zhì)及細胞核的多態(tài)性豐富，而且不育系選出比率較高。但遺憾的是在該材料中并未鑒定出保持系單株個體。要想選育出保持系必須加大選育的群體數(shù)量。

3.2 該方法可以進入實際育種中應用，可以大大提高甜菜不育系、保持系的選育效率，加快育種進程。

3.3 完備的育種設施是加快育種進程必不可少的條件。如配備春化處理室、育種溫室對選育后的不育系或保持系單株采種意義重大。