多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因分析與抗菌中藥篩選

楊雪瓊，陳錫嬌，高玉芳，周熠炯，張璽威，陳劍濤，陳 鑫

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 佛山 528000）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa，PA）是我國院內(nèi)感染常見的條件致病菌之一，近年來在院內(nèi)感染中的檢出率不斷上升[1]，全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CARSS）最新數(shù)據(jù)顯示，銅綠假單胞菌的臨床分離率位居第3，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。隨著抗菌藥物的廣泛使用特別是濫用，銅綠假單胞菌的耐藥問題日趨嚴(yán)重，耐藥菌株不斷出現(xiàn)而且多呈多重耐藥性，而多重耐藥銅綠假單胞菌（Multidrug-resistant Pseudomonas Aeruginosa，MDRPA）常與全球流行病暴發(fā)有關(guān)，可導(dǎo)致很高的發(fā)病率和死亡率[2]，給臨床治療MDRPA感染帶來了巨大挑戰(zhàn)。因此，本研究對(duì)從佛山市某大型三甲綜合醫(yī)院收集后篩選得到的MDRPA菌株進(jìn)行耐藥特性分析，以期為臨床治療MDRPA感染提供用藥參考依據(jù)。

此外，大量研究報(bào)道中藥在治療細(xì)菌感染方面有其獨(dú)特的作用，且具有不易產(chǎn)生耐藥、毒副作用小、資源豐富等優(yōu)勢(shì)[3]；另外臨床抗感染經(jīng)驗(yàn)表明，單一用藥對(duì)銅綠假單胞菌的治療并不理想，容易產(chǎn)生耐藥，許多權(quán)威機(jī)構(gòu)主張聯(lián)合用藥。因此，本研究在研究耐藥機(jī)制的同時(shí)，從20種清熱解毒中藥中篩選對(duì)MDRPA具有體外抗菌活性的中藥并進(jìn)行聯(lián)合用藥研究，以獲得最佳的中藥聯(lián)用組合，為中藥的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考的同時(shí)為臨床治療MDRPA感染提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株

從佛山市某大型三甲綜合醫(yī)院的臨床檢驗(yàn)科收集50株臨床分離的銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌（ATCC27853）為質(zhì)控菌株（購于國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨檢中心）。

1.2 藥物與試劑

黃連、半枝蓮、金銀花、射干、大葉青、赤芍、蒲公英、白花蛇舌草、板藍(lán)根、魚腥草、決明子、知母、黃芩、夏枯草、梔子、牡丹皮、蘆根、生地黃、石膏、菊花（購于青島醫(yī)保城醫(yī)藥公司）；營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉（購于青島海博生物）；氨基糖苷修飾酶、碳青霉烯酶等引物，DNA染色劑、瓊脂糖、Premix Taq（購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；抗生素藥敏紙片（購于杭州微生物試劑有限公司）。

1.3 主要儀器

智能恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋（購于廣州科曉科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（購于廣州沃霖實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；PCR儀（購于美國Bio-Rad公司）；電泳儀（購于六一生物科技有限公司）；凝膠紫外成像分析儀（購于上海嘉鵬科技有限公司）；微量移液器和多道移液器（購于梅特勒—托利多國際有限公司）；酶標(biāo)儀、微型離心管（EP管）、96孔聚苯乙烯板、一次性培養(yǎng)皿等（購于廣州步前生物科技有限公司）；Eppendorf離心機(jī)（購于艾本德中國有限公司）。

1.4 銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片法（K-B法）對(duì)臨床分離的50株銅綠假單胞菌進(jìn)行初篩。操作如下：（1）菌液準(zhǔn)備：將收集來自-80℃冰箱的銅綠假單胞菌菌株取出，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基平板進(jìn)行復(fù)蘇，連續(xù)傳兩代（細(xì)菌狀態(tài)穩(wěn)定）后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌落2～4個(gè)（約1 mm）混于2～3 mL MH肉湯培養(yǎng)基中，配成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?；?）接種及貼藥：取350 μl上述菌懸液均勻涂布于MH肉湯培養(yǎng)基平板，15 min內(nèi)間隔一定距離貼上抗生素藥敏紙片；（3）培養(yǎng)：37℃溫箱培養(yǎng) 16～18 h；（4）結(jié)果判定：讀取并記錄培養(yǎng)后MH平板上抗生素藥敏紙片周圍的抑菌圈，對(duì)照CLSI標(biāo)準(zhǔn)得出相應(yīng)抗生素對(duì)菌株的抑菌效果，從而篩選出MDRPA[4]。

1.5 耐藥機(jī)制研究——耐藥基因檢測(cè)

（1）聚合酶鏈反應(yīng)：①制備模板：取4～6個(gè)菌落（約1 mm）于 100 μl雙蒸水（ddH2O）中，100℃煮沸 10 min，再以 14 000 rpm離心5 min，上清液即可作為模板。

②引物處理：氨基糖苷修飾酶基因[包括rmtB、an（t2”）-I、armA、aac（3）-Ib、rmtA、aac（6”）-II）、金屬 β- 內(nèi)酰胺酶基因（包括 blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaSIM、blaGIM]、苯唑西林酶（blaOXA-2、blaOXA-10）引物是通過指導(dǎo)教師協(xié)助查閱NCBI網(wǎng)站基因序列而設(shè)計(jì)的，并委托上海生工生物工程有限公司合成。合成后的引物按照說明加相應(yīng)的無菌ddH2O，配成100 μm的引物，稀釋 10 倍（取 10 μl加到 90 μl無菌 ddH2O中），配成濃度為10 μm 的引物。

③PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系如下（總體系10 μl）：每反應(yīng)體系含Taq 酶 5 μl、引物 F 和 R 各 0.5 μl、模板 0.8 μl和 ddH2O 3.2 μl。加樣完成后進(jìn)行94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30個(gè)周期；最后72℃延長(zhǎng)至5 min。

（2）瓊脂糖凝膠電泳[5]：①制膠：本實(shí)驗(yàn)配1.5%的瓊脂糖電泳膠，稱取1.5 g瓊脂粉溶于100 mL TAE液（Tris-乙酸-EDTA）中，100℃加熱2 min溶解，根據(jù)說明書加入相應(yīng)的DNA染色劑，將未凝固的膠倒在制膠板上，待其凝固后垂直拔起梳子。

②加樣：將擴(kuò)增的產(chǎn)物加到瓊脂糖凝膠中，凝膠加樣處靠近負(fù)極（黑色電極），第1個(gè)加樣孔加marker做對(duì)照，選用100bp的marker。

③電泳：接通電源，120 V電泳30 min左右，將電泳后的凝膠置于凝膠紫外成像分析儀觀察是否出現(xiàn)與目的基因大小一致的擴(kuò)增條帶，若有則表明細(xì)菌能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的鈍化酶。

1.6 中藥提取物的制備

采用煮沸法制備中藥提取物。取各種中藥15 g分別浸泡于250 mL超純水1 h；用砂鍋細(xì)火煮2 h，趁熱過濾、收集濾液；在殘?jiān)屑尤?50 mL超純水，再煮2 h，將兩次過濾后的濾液混合，加熱濃縮至15 mL，即可得到濃度為1 000 mg/mL的中藥提取物。將制備好的藥液裝入瓶中加蓋，用高壓蒸汽滅菌鍋高壓滅菌（121℃，15 min），待冷卻后放于 4℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。

1.7 微量肉湯稀釋法

微量肉湯稀釋法可測(cè)出中藥對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC），從而篩選出抗菌效果較好的中藥以及有代表性的菌株進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。

在超凈工作臺(tái)中，取無菌96孔板，先做好標(biāo)記，在第1排的第1個(gè)孔加入用MH液體培養(yǎng)基稀釋到100 mg/mL的中藥藥液200 μl，第2～11排每孔依次加入100 μl MH液體培養(yǎng)基，第12排加入200 μl。再用多道移液器從第1列中取100 μl中藥藥液至第2排孔，混勻，依此類推至第10排，棄去100 μl，以達(dá)到中藥藥液的倍比稀釋，從第1—11排每孔依次加入0.5麥?zhǔn)蠁挝挥肕H液體培養(yǎng)基稀釋1 000倍的菌液100 μl，最后將96孔板密封置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～20 h。觀察結(jié)果：在陽性對(duì)照有細(xì)菌生長(zhǎng)且陰性對(duì)照無細(xì)菌生長(zhǎng)的前提下，小孔內(nèi)澄清無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最小抑菌濃度，但若細(xì)菌生長(zhǎng)在不連續(xù)孔時(shí)，則該實(shí)驗(yàn)可能是藥物混勻不當(dāng)，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)[7]。

1.8 棋盤法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

根據(jù)微量肉湯稀釋法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)半枝蓮、夏枯草、黃芩、黃連這4種中藥對(duì)12株菌的抑制效果較為明顯并得出相應(yīng)的MIC。采用棋盤法檢測(cè)中藥的聯(lián)合作用，使用8個(gè)稀釋倍數(shù)，用中藥單用時(shí)MIC的4倍濃度作為藥物最高濃度，而后用MH培養(yǎng)基依次倍比稀釋，分別為 4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 倍MIC。倍比稀釋均在96孔板中操作，第9、10列孔分別加入A、B各不同梯度濃度的提取物作為參考，每孔各100 μl，第11列孔不加藥作為陽性對(duì)照，第12列孔不加藥不加菌作為陰性對(duì)照（加MH培養(yǎng)基）。然后在第1—11孔各加配好的實(shí)驗(yàn)菌懸液100 μ（l接種菌量為1×105CFU/mL），加完后用酶標(biāo)儀測(cè)吸光值（OD），最后置于37℃培養(yǎng)箱中孵育 18～24 h，培養(yǎng)完后再測(cè)OD值，觀察培養(yǎng)前后吸光度變化，得出中藥聯(lián)用后的MIC并計(jì)算其部分抑菌濃度指數(shù)（FIC=A藥聯(lián)用時(shí)MIC/A藥單用時(shí)MIC+B藥聯(lián)用時(shí)MIC/B藥單用時(shí)MIC）。FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC＜1為部分協(xié)同作用，F(xiàn)IC=1為相加作用，1＜FIC≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為拮抗作用[8]。

2 結(jié)果

2.1 藥敏紙片法結(jié)果

采用K-B法對(duì)50株銅綠假單胞菌進(jìn)行初篩得到20株MDRPA，根據(jù)CLSL標(biāo)準(zhǔn)得到20株MDRPA的耐藥情況。這些菌株對(duì)青霉素G、紅霉素、頭孢唑啉、氨芐西林的耐藥率達(dá)到了100%，對(duì)諾氟沙星的耐藥率最低（8%），對(duì)亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星的耐藥率見圖1。

圖1 20株MDRPA對(duì)抗菌藥物的耐藥情況

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

ant（2"）-I和bla SIM的檢出率最高，分別為100%、87%，aac（3）-Ib、aac（6”）-II、blaIMP、blaVIM、blaGIM基因未檢出，具體結(jié)果見圖2。

圖2 MDRPA常見的耐藥基因及檢出率

2.3 微量肉湯稀釋法結(jié)果

通過微量肉湯稀釋法得到的20種中藥中，黃芩（MIC：1.56～6.25 g/L）、半枝蓮（MIC：3.13～6.25 g/L）、夏枯草（MIC：3.13～25.00 g/L）、黃連（MIC：6.25～25.00 g/L）對(duì) 20 株 MDRPA中的12株的抑菌效果較好，選擇它們進(jìn)行棋盤法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。

2.4 棋盤法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過微量肉湯稀釋法可得出中藥在單用和聯(lián)用時(shí)對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度，結(jié)果見表1～3。從各中藥組合的棋盤法結(jié)果來看，黃芩+半枝蓮組合（具有協(xié)同作用比例為75%，部分協(xié)同作用比例為25%）與黃芩+夏枯草組合（具有協(xié)同作用比例為58%，部分協(xié)同作用比例為42%）對(duì)MRDPA的抑菌效果最好。

表1 棋盤法黃芩與半枝蓮聯(lián)用時(shí)的MIC（g/L）

表2 棋盤法黃芩與夏枯草聯(lián)用時(shí)的MIC（g/L）

表3 兩種效果較好的中藥組合的部分抑菌濃度（%）

3 討論

3.1 部分耐藥基因可編碼產(chǎn)生鈍化酶引起PA耐藥

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，PA耐藥發(fā)展迅速，對(duì)常見的抗菌劑的耐藥率不斷上升，耐藥菌株日益增加[9]。此外，銅綠假單胞菌嚴(yán)重感染者病死率高，臨床上治療普遍比較棘手。解決這個(gè)難題的關(guān)鍵在于找出細(xì)菌的耐藥機(jī)制，為臨床合理用藥提供依據(jù)。常見的細(xì)菌耐藥機(jī)制包括鈍化酶的產(chǎn)生、藥物作用靶點(diǎn)改變、主動(dòng)外排機(jī)制、細(xì)菌生物被膜作用等。本研究在研究細(xì)菌耐藥機(jī)制中選取了相對(duì)重要的機(jī)制——鈍化酶的產(chǎn)生，大量研究發(fā)現(xiàn)，鈍化酶可以水解或修飾抗生素結(jié)構(gòu)而引起抗生素失活。（1）細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥取決于氨基糖苷修飾酶，氨基糖苷修飾酶主要有N－乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、O-核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）等，其通過共價(jià)修飾的方法使氨基糖苷類抗生素對(duì)細(xì)菌的作用效果減弱，從而導(dǎo)致耐藥[10]。本實(shí)驗(yàn)中ant（2”）-I耐藥基因檢出率最高，推斷出細(xì)菌可能產(chǎn)生氨基糖苷修飾酶使慶大霉素和阿米卡星降解。（2）檢出率居其次的為bla SIM、bla SPM，有研究報(bào)道，該酶基因位于染色體或質(zhì)粒上，可通過轉(zhuǎn)座子、整合子等移動(dòng)元件進(jìn)行傳播，一旦有MBL耐藥基因存在，很容易進(jìn)行水平傳播，進(jìn)而導(dǎo)致臨床中該類菌的耐藥率不斷升高[11]。（3）有研究表明，苯唑西林酶可能是因?yàn)榘奔柞；?內(nèi)酰胺類抗生素的活性位點(diǎn)Lys-70殘基，從而產(chǎn)生耐藥[12]。

3.2 中藥聯(lián)合對(duì)MDRPA有抑菌活性

有研究顯示，中藥在治療細(xì)菌感染方面有較好的效果。結(jié)合中藥的諸多優(yōu)勢(shì)，本研究小組經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芩+半枝蓮、黃芩+夏枯草這兩個(gè)中藥聯(lián)用組合抑菌活性較好，由此推斷出黃芩在與半枝蓮或夏枯草混用時(shí)可能發(fā)生某些生化機(jī)制使得藥物更好地發(fā)揮其抑菌作用，但本研究尚未深入了解，只可為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

綜上，在抗菌藥物耐藥日益嚴(yán)重的形勢(shì)下，研究細(xì)菌的耐藥機(jī)制的基因水平和開發(fā)新型治療方案極為重要，可為臨床合理使用抗菌藥物以及控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生、變遷和傳播提供理論依據(jù)。我國中藥資源豐富，且目前中藥不易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，因此未來與中藥相關(guān)的研究可能會(huì)越來越多。而本研究關(guān)于中藥聯(lián)用的抑菌活性，可為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)并為臨床用藥提供參考。