外泌體在冠心病治療中應(yīng)用的研究新進(jìn)展

尹亮，史博群，劉德敏，谷國(guó)強(qiáng)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。–AHD，冠心?。┦枪跔顒?dòng)脈（冠脈）血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化（AS）而引起血管狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，是冠脈疾病中的一種常見疾病。全面了解其發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制，對(duì)于改善冠心病患者的預(yù)后至關(guān)重要[1]。

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一個(gè)亞群，其內(nèi)容物的變化可能提示生理或病理變化，被臨床診斷學(xué)廣泛視為關(guān)鍵生物標(biāo)志物。本文旨在從外泌體的發(fā)生、分泌和攝取為出發(fā)點(diǎn)，就其在冠心病的診斷和治療等方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 外泌體的早期發(fā)現(xiàn)

外泌體生物形成機(jī)制十分復(fù)雜。但隨著相關(guān)分離技術(shù)和檢測(cè)水平的不斷提升，目前對(duì)外泌體的研究已成為各學(xué)科的熱點(diǎn)問題[2]。小細(xì)胞囊泡的描述最早出現(xiàn)于1960年，Bonucci和Anderson觀察到軟骨細(xì)胞分泌直徑約100 nm的小囊泡。同時(shí)Wolf首先報(bào)道了血小板能夠釋放細(xì)胞外囊泡（稱為血小板塵），并且它們具有顯著的促凝血作用。與外泌體相關(guān)的研究從1980年開始，Trams等第一次發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞可分泌兩種大小的囊泡，一種是直徑約40 nm的小囊泡，另一種是直徑約500 nm的大囊泡。他們最終采用微囊泡描述更大的囊泡，而“外泌體”則被用于描述更小的囊泡[3]。

2 外泌體的生物發(fā)生、分泌和攝取

細(xì)胞外囊泡是由不同類型細(xì)胞釋放的一類膜結(jié)合相關(guān)的細(xì)胞器，包含許多生物活性分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等。這些囊泡根據(jù)大小、生成部位和含量的不同，分為凋亡體、微囊泡和外泌體[4]。外泌體形成相對(duì)復(fù)雜，細(xì)胞膜向內(nèi)出芽形成早期內(nèi)體，隨后內(nèi)泌體膜再次向內(nèi)萌發(fā)形成晚期內(nèi)泌體，晚期內(nèi)泌體內(nèi)含各種腔內(nèi)囊泡，將其命名為多囊泡體[5]。細(xì)胞內(nèi)的多囊泡體通過(guò)與溶酶體直接融合后降解，也可通過(guò)與細(xì)胞膜融合向細(xì)胞外釋放腔內(nèi)囊泡。這些由細(xì)胞膜向外釋放的腔內(nèi)囊泡被稱為外泌體[6]（圖1）。外泌體又稱小細(xì)胞外囊泡，是由磷脂包被的結(jié)構(gòu)，通常直徑在30～150 nm之間，在透射電鏡下呈杯狀，并且?guī)缀跛屑?xì)胞都能釋放外泌體[4,7]。外泌體包含多種遺傳信息，如蛋白質(zhì)、microRNA（miRNA）和mRNA。外泌體富含miRNA，其通過(guò)旁分泌或內(nèi)分泌作用，參與了許多基本的細(xì)胞功能（包括細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、免疫調(diào)節(jié)等）。且與血漿中的miRNA相比，外泌體miRNA在生物體液中高度穩(wěn)定，外泌體的脂質(zhì)雙層可保護(hù)miRNA免受體液的酶促降解，導(dǎo)致相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間且穩(wěn)定的表達(dá)[7]。外泌體具有體積小，免疫原性低等生物學(xué)特點(diǎn)，可作為冠心病潛在的生物標(biāo)志物。

圖1 外泌體生物發(fā)生、分泌、攝取過(guò)程

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)小G蛋白（GTPase）、RAL-1（與Ras相關(guān)的GTPase同源物）、雷帕霉素復(fù)合物的機(jī)制靶點(diǎn)1（mTORC1）等幾個(gè)關(guān)鍵分子參與細(xì)胞膜融合以及外泌體的釋放[4,8]。這些轉(zhuǎn)運(yùn)分子將多囊泡體向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)并與參與質(zhì)膜融合，還參與外泌體的分泌。其中Rab家族中小GTPase成員在細(xì)胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)移中起重要作用，還涉及多囊泡體轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜進(jìn)行外泌體分泌的過(guò)程[8]。

已知的外泌體攝取機(jī)制包括：融合、結(jié)合和內(nèi)吞作用。外泌體外膜可直接與受體細(xì)胞膜融合后，外泌體中的蛋白質(zhì)、miRNA、mRNA會(huì)被釋放到受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而影響受體細(xì)胞的一系列功能[4]。不僅如此，外泌體與細(xì)胞外配體結(jié)合后，再與受體細(xì)胞結(jié)合，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響受體細(xì)胞功能。此外，內(nèi)吞作用的機(jī)制差異很大，其中包括微胞作用、吞噬作用、小泡介導(dǎo)??的內(nèi)吞作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等[9,10]。Eguchi等[9]發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用來(lái)內(nèi)化外泌體來(lái)源的miRNA，此過(guò)程在抗心肌細(xì)胞凋亡起到重要作用。

3 不同細(xì)胞來(lái)源外泌體與冠心病

眾所周知，AS是一個(gè)多因素作用的慢性過(guò)程。隨時(shí)間推移，動(dòng)脈粥樣斑塊可導(dǎo)致管壁纖維化加重以及鈣鹽沉積。進(jìn)展期動(dòng)脈粥樣斑塊可侵犯動(dòng)脈管腔，阻礙血流通過(guò)，導(dǎo)致組織缺血。當(dāng)它影響心臟自身循環(huán)時(shí)可能會(huì)引起急性冠脈綜合征（如心肌梗死）；也可導(dǎo)致慢性疾?。ㄈ绶€(wěn)定型心絞痛[11]）?？梢姽谛牟〉陌l(fā)病與AS密切相關(guān)。外泌體通過(guò)miRNA和其他介質(zhì)參與心肌細(xì)胞的旁分泌和內(nèi)分泌過(guò)程。干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板釋放的外泌體為冠心病的診斷及治療提供了有價(jià)值的生物學(xué)信息[5]。

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體 間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的能力、良好的體外培養(yǎng)和操作特性、較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性等優(yōu)勢(shì)，所以在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[12]。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞雖不能直接取代受損組織，但可通過(guò)旁分泌效應(yīng)發(fā)揮治療作用，其中外泌體被認(rèn)為是關(guān)鍵因子之一[13]。Teng等[14]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)受損心肌的保護(hù)作用主要依賴其促血管生成活性。在大鼠心肌梗死模型中，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管過(guò)程，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫功能縮小了梗死面積，改善心臟功能。這項(xiàng)研究表明外泌體可顯著促進(jìn)心血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管，并降低了脾臟淋巴細(xì)胞的增殖。Feng等[15]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌富含miRNA-22的外泌體通過(guò)直接靶向甲基CpG結(jié)合蛋白2（Mecp2）介導(dǎo)心肌抗凋亡作用，顯著減輕心肌纖維化。

3.2 內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體 活化的內(nèi)皮細(xì)胞在AS的發(fā)展中起重要作用，因?yàn)樗鼈兪怯裳芷交〖?xì)胞異常增生而形成的新生內(nèi)膜。值得注意的是，內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以調(diào)節(jié)炎癥和單核細(xì)胞的活化及遷移，其通過(guò)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，減輕心肌細(xì)胞缺血/再灌注（I/R）損傷[16]。Saez等[17]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者中，內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的外泌體在高糖狀態(tài)下促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達(dá)，提示外泌體可能作為單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的通訊機(jī)制，在高糖狀態(tài)下誘導(dǎo)和維持兩種類型細(xì)胞的激活。Hu等[18]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)傳遞miRNA-21-5p調(diào)節(jié)血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)激活CD137信號(hào)通路可減少10/11易位家族蛋白2（TET2）含量并增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體轉(zhuǎn)移到血管平滑肌細(xì)胞來(lái)促進(jìn)新內(nèi)膜的形成。

3.3 平滑肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體 成熟的可收縮血管的平滑肌細(xì)胞是一種靜態(tài)細(xì)胞。其通過(guò)維持血管壁的完整性和調(diào)節(jié)動(dòng)脈張力，在血管的傳導(dǎo)功能中起著關(guān)鍵作用。衰老、氧化應(yīng)激、炎癥和機(jī)械損傷等刺激可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞表型改變，血管平滑肌細(xì)胞從收縮狀態(tài)向“合成”狀態(tài)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致血管病變，包括AS、血管鈣化和再狹窄。外泌體在血管修復(fù)過(guò)程、病理性血栓形成和鈣化中發(fā)揮著新的作用[20]。血管平滑肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體可介導(dǎo)Krüppel樣因子5（KLF5）誘導(dǎo)miRNA-155從平滑肌細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移，增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)AS進(jìn)展[21]。Qiu等[22]發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體是一種新的血管內(nèi)血栓形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)介質(zhì)，提示血管平滑肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體介導(dǎo)的功能失調(diào)可能干擾血管穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致冠心病發(fā)生。

3.4 心肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體 越來(lái)越多的證據(jù)表明，心肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體在冠心病的進(jìn)展中起著重要作用。心肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體的產(chǎn)生和釋放受多種因素的影響。近期研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白20（HSP20）通過(guò)與腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）的相互作用介導(dǎo)外泌體在心肌細(xì)胞中的生物形成及分泌[23]。心肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)轉(zhuǎn)移糖酵解酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解通量，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞的功能[24]。Yang等[25]發(fā)現(xiàn)雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶2（DYRK2）為miRNA-208a的靶基因，心肌細(xì)胞通過(guò)分泌富含miRNA-208a的外泌體參與心肌纖維化，外泌體促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并分化為肌成纖維細(xì)胞。而在小鼠心肌梗死模型中，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)抑制富含miRNA-208a的外泌體可減輕心肌纖維化，改善心肌梗死后小鼠心功能。同時(shí)將含miRNA-208a的外泌體輸入正常大鼠，會(huì)導(dǎo)致心功能惡化。Wang等[26]證明了miRNA-92a作為Smad蛋白7（Smad7）轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，而Smad7是α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的一種抑制劑。心肌梗死后心肌細(xì)胞中miRNA-92a上調(diào)，減弱Smad7介導(dǎo)的對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)錄的抑制，從而觸發(fā)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。這種通路對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的激活至關(guān)重要。

3.5 脂肪細(xì)胞來(lái)源的外泌體 脂肪組織是循環(huán)外泌體miRNA的主要來(lái)源之一，這些外泌體中miRNA可以調(diào)節(jié)遠(yuǎn)處組織的基因表達(dá)，從而成為新的脂肪因子[27]。脂肪組織的內(nèi)分泌功能為肥胖與AS的聯(lián)系機(jī)制提供了重要的線索。據(jù)報(bào)道，脂肪因子和細(xì)胞因子通常影響脂肪和葡萄糖的代謝。而在肥胖的情況下直接影響血管功能，在AS形成中發(fā)揮重要作用[28]。Gan等[29]證實(shí)miRNA-130b-3p聚集在功能失調(diào)的脂肪細(xì)胞來(lái)源的小細(xì)胞外囊泡中，抑制心肌細(xì)胞中多種抗凋亡和保護(hù)心肌細(xì)胞分子，從而加重糖尿病患者心肌的I/R損傷。Deng等[30]發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)激活S1P/SK1/S1PR1信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化來(lái)改善心肌梗死后的心肌損傷。并且其通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB（NF-κB）通路，可降低ICAM的表達(dá)，減輕低密度脂蛋白受體缺陷小鼠的AS[31]。

4 外泌體在冠心病潛在的診斷和治療應(yīng)用

近年來(lái)，外泌體在冠心病的診斷和治療潛力得到了越來(lái)越多的研究[4]。冠心病中特別是心肌梗死方面是目前外泌體研究的熱點(diǎn)，并主要圍繞各種保護(hù)因子展開。在基因?qū)用嫔?，外泌體攜帶的miRNA-30a抑制劑可通過(guò)下調(diào)自噬激活激酶1（ULK1）和自噬基因編碼蛋白-1（Beclin-1）水平來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡。Xu等[32]隨機(jī)將30只小鼠分成假手術(shù)組、模型組、miRNA30a抑制劑組，結(jié)扎模型組及miRNA-30a抑制劑組的前降支血管，模型組與假手術(shù)組相比，心臟組織的病理?yè)p傷嚴(yán)重，血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和肌酸激酶（CK）水平升高，丙二醛（MDA）含量降低，超氧化物歧化酶（SOD）含量升高，心臟細(xì)胞凋亡率明顯增加。同時(shí)模型組心臟組織中自噬相關(guān)蛋白ULK1和Beclin-1水平也顯著增加。而miRNA-30a抑制劑組結(jié)果與之相反。不僅如此，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者外泌體中的miRNA-30a水平呈時(shí)間依賴性升高[33]。

Peng等[34]將miRNA-122-5p模擬物轉(zhuǎn)染給小鼠H9C2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)血漿中miRNA-122-5p的水平明顯升高。miRNA-122-5p模擬物處理過(guò)表達(dá)X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物（XIST）的H9C2細(xì)胞后，其細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力均下降。與此同時(shí)miRNA-122-5p模擬物可以顯著增加心肌細(xì)胞凋亡程度，降低B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）蛋白表達(dá)，增加低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）及凋亡因子（如Bax、caspase-9）表達(dá)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)血清中高miRNA-122-5p/133b比值所反映的miR122-5p的相對(duì)升高是一種預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，可用于識(shí)別預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)較高的ST段抬高型心肌梗死患者。當(dāng)聯(lián)合左心室射血分?jǐn)?shù)，早期預(yù)后價(jià)值則明顯上升[33]。

Zhao等[35]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)度表達(dá)miRNA-328后激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），增強(qiáng)了膠原蛋白沉積并誘發(fā)心臟纖維化，并且在敲除小鼠內(nèi)源性miRNA-328后消除了這種作用。此外，心肌細(xì)胞來(lái)源的miRNA-328通過(guò)旁分泌轉(zhuǎn)運(yùn)至心肌成纖維細(xì)胞，過(guò)表達(dá)刺激TGF-β信號(hào)通路，包括上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和磷酸化smad2/3的表達(dá)，下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體Ⅲ（TGF-βRⅢ），最終導(dǎo)致膠原蛋白含量的增加。miRNA-328作為一種通過(guò)旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致心臟纖維化的新型分子機(jī)制，證明了miRNA-328是潛在的治療靶點(diǎn)。Xiao等[36]發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌缺血模型H9C2細(xì)胞中敲除miRNA-134可減輕心肌I/R損傷，通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶（PI3K/Akt）通路并靶向一氧化氮合酶3（NOS3），減弱心肌凋亡并增強(qiáng)增殖能力。臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相比于健康對(duì)照組，急性心肌梗死患者血漿外泌體中miRNA-328和miRNA-134水平明顯升高，在經(jīng)過(guò)年齡和性別矯正后二者仍與患者6月內(nèi)死亡或心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)密切相（OR=7.35，P＜0.001 vs. OR=2.28，P＜0.001），因此血漿中miRNA-328和miRNA-134是重要的死亡預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[37]。

在蛋白層面上，外泌體在抑制心室重構(gòu)，改善心功能發(fā)揮重要作用。如間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)傳遞白細(xì)胞介素10（IL-10）和TGF-β等來(lái)抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[38]。Yamaguchi等[39]證實(shí)心肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體富含胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）有助于改善心肌梗死后的心功能。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

我們討論了外泌體的生物發(fā)生、分泌和攝取及其在冠心病治療應(yīng)用的最新研究結(jié)果。目前研究表明，關(guān)于外泌體相關(guān)知識(shí)很大一部分來(lái)自培養(yǎng)的細(xì)胞或者缺乏生理或臨床相關(guān)性囊泡濃度的研究，對(duì)人體中心臟、血管壁和循環(huán)細(xì)胞釋放的外泌體知之甚少[40]。但外泌體生物學(xué)代表了未來(lái)治療心臟疾病的一個(gè)引人入勝的領(lǐng)域，通過(guò)靶向手段可能作為治療冠心病的新的方向。因此，外泌體在冠心病的臨床診斷和治療中充滿希望，但仍需更多的臨床和基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步探討證實(shí)。