一例鴨傳染性漿膜炎的診斷

葛向平

（山東省膠州市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 266300）

鴨傳染性漿膜炎由鴨疫里默氏桿菌（Rimerella anatipestifer，RA）引起的一種慢性或急性敗血性傳染病，又稱為鴨疫里默氏菌病，本病無(wú)明顯季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，春冬季節(jié)較為多發(fā)，通常具有1～3d 的潛伏期，有時(shí)達(dá)到7d 左右。該病的主要傳播途徑是呼吸道或感染的皮膚傷口，空氣傳播是重要的傳播途徑之一，感染該病原菌后主要侵害雛鴨，除此之外也可侵害雞、鵝、鵪鶉等多種禽類，主要癥狀為纖維素性氣囊炎、心包炎和肝周炎[1]，發(fā)病鴨出現(xiàn)站立不穩(wěn)、飲食廢絕、精神萎靡、頭部震顫等一系列神經(jīng)癥狀，嚴(yán)重阻礙鴨的生長(zhǎng)，鴨發(fā)病率為5%～90%，病死率高達(dá)80%，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要細(xì)菌性傳染性疾病。

鴨疫里默氏桿菌在自然界分布廣泛，公認(rèn)的有21 種血清型[2]，報(bào)道中分離的鴨疫里默氏桿菌也有多種血清型，李書光等在50 日齡種鴨分離到一株2 型鴨疫里默氏桿菌[3]，郝東敏等在13 日齡肉鴨中分離到一株7 型鴨疫里默氏桿菌[4]，孔桂慧等從29 周齡產(chǎn)蛋鴨分離到一株1 型鴨疫里默氏桿菌[5]，由于不同鴨疫里默氏桿菌血清型之間的交叉免疫保護(hù)力差，臨床上使用抗生素不規(guī)范、濫用，加大了該病的防治難度[6-7]。

2020 年6 月份，山東省某地一養(yǎng)鴨場(chǎng)的鴨群發(fā)病，懷疑鴨傳染性漿膜炎，遂送樣進(jìn)行診斷。

1 發(fā)病情況

一養(yǎng)鴨場(chǎng)14 日齡雛鴨出現(xiàn)精神不振、采食下降等現(xiàn)象，并出現(xiàn)癱瘓、神經(jīng)癥狀，每天死亡50 只左右，剖檢死亡鴨可見纖維素性氣囊炎、心包炎和肝周炎。根據(jù)患病鴨的臨床癥狀及病理解剖變化，初步懷疑該鴨群感染了鴨疫里默氏菌病，為了進(jìn)一步確定該病原，進(jìn)行病原分離、鑒定。

2 病原分離

在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)取肝臟、腦和心臟，分別接種到麥康凱培養(yǎng)基和含2%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基，將麥康凱培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，TSA 培養(yǎng)基置37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h 后發(fā)現(xiàn)TSA 培養(yǎng)基均出現(xiàn)邊緣整齊的圓形菌落（圖1），而在麥康凱培養(yǎng)基上沒有菌落生長(zhǎng)。

3 病原鑒定

3.1 鏡檢

將分離的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)特點(diǎn)，結(jié)果革蘭氏陰性短桿菌（圖2）。

3.2 生化鑒定

參考生化反應(yīng)管說(shuō)明書，將分離菌分別接種于微量生化發(fā)酵管中觀察結(jié)果。分離菌不發(fā)酵乳糖、半乳糖、葡萄糖、果糖，甲基紅、硫化氫產(chǎn)氣試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)均為陰性，明膠試驗(yàn)和過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，符合該菌的生化特性。

3.3 血清型鑒定

挑選單個(gè)菌落接種含2%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h 后洗脫菌液，與鴨疫里默氏桿菌1 型、2 型、7 型、10型陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集發(fā)現(xiàn)，與7 型陽(yáng)性血清能發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，與其他型不發(fā)生凝集反應(yīng)，可見分離菌的血清型為鴨疫里默氏菌7 型。

3.4 藥敏試驗(yàn)

將分離的試驗(yàn)菌涂布在含2%牛血清的TSA 培養(yǎng)基上，盡可能均勻，將大觀霉素、阿莫西林、紅霉素、頭孢唑肟、多黏菌素、磷霉素藥敏片貼在平板上，進(jìn)行常規(guī)藥物的藥敏試驗(yàn)，置37℃、含5%CO2微氧氣條件下培養(yǎng)24～48h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該分離菌株對(duì)大觀霉素、阿莫西林、紅霉素、頭孢唑肟高度敏感，對(duì)多黏菌素、磷霉素不敏感。

3.5 PCR 鑒定

用鴨疫里默氏桿菌特異性引物進(jìn)行PCR 鑒定，引物序列如下，F(xiàn)：5'-ATTAGTATTGAAAGCTCCG-3'，R：5'-TCCGAAGAAAACCGTATT-3'，擴(kuò)增片段約為800bp，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。取菌液2ml，3000rpm 離心5min，棄上清，用無(wú)菌dd H2O 重懸菌液，煮沸10min，5000rpm 離心5min，取上清液作為模板；PCR 體系：PCR mix12.5μl、模板2μl、上游引物各1μl、下游引物1μl，補(bǔ)足無(wú)菌dd H2O 至25μl，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸45s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。結(jié)束后，取PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察結(jié)果，結(jié)果與預(yù)期相符，出現(xiàn)大小約為800bp 的目的條帶（圖3），由此可以確定該場(chǎng)雛鴨感染了鴨疫里默氏桿菌。

3.6 分離菌株對(duì)雛鴨的致病力試驗(yàn)

將新鮮培養(yǎng)的鴨疫里默氏桿菌接種TSA 平板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h 后，用無(wú)菌PBS 洗滌，洗滌兩次，最后用PBS 重懸并調(diào)整至菌數(shù)為2×106CFU/mL，腿部肌肉接種20日齡櫻桃谷鴨10 只，1ml/只，接種后10d 內(nèi)雛鴨全部死亡，剖檢可見明顯的纖維素性氣囊炎、心包炎和肝周炎，表明該株菌對(duì)雛鴨確有較強(qiáng)的致病力。

4 小結(jié)

隨著養(yǎng)鴨業(yè)的不斷發(fā)展，規(guī)模化養(yǎng)殖越來(lái)越多，養(yǎng)殖密度的增加導(dǎo)致鴨傳染性漿膜炎的發(fā)病率越來(lái)越高，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而此類疾病在診斷過程中很容易與大腸桿菌感染混淆，本試驗(yàn)通過對(duì)剖檢鴨進(jìn)行細(xì)菌分離、生化鑒定、PCR 鑒定、血清學(xué)鑒定、動(dòng)物回歸等一系列試驗(yàn)表明，分離的菌為鴨疫里默氏桿菌7 型，實(shí)驗(yàn)室通過藥敏試驗(yàn)及時(shí)給養(yǎng)殖戶提供了治療及用藥方向。

目前，鴨疫里默氏桿菌公認(rèn)的血清型有21 種，程安春等報(bào)道鴨疫里默氏桿菌還存在新的血清型（22～25 型）[8]。由于不同血清型的抗原性存在差異，無(wú)交叉免疫保護(hù)力，而且研究發(fā)現(xiàn)，不同省份地區(qū)鴨疫里默氏桿菌優(yōu)勢(shì)血清型分布也有差異[9-12]，這給鴨疫里默氏桿菌病的免疫防治帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。

市場(chǎng)可用的鴨傳染性漿膜炎預(yù)防疫苗主要有單價(jià)或多價(jià)滅活疫苗，飼養(yǎng)過程中一定要合理進(jìn)行科學(xué)免疫，嚴(yán)格控制抗生素等藥物的使用，同時(shí)，改善飼養(yǎng)環(huán)境，規(guī)范養(yǎng)殖，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期更換墊料，另外，建議根據(jù)本地區(qū)的鴨疫里默氏桿菌流行血清型選擇合適的疫苗進(jìn)行免疫，多舉并措，才能有效預(yù)防和減少此類疾病的發(fā)生。