滑動弧放電等離子體對枯草芽孢桿菌的滅菌機理

崔魯彬，孫運金，2，王雪瑩，王 艷

(1.北京農學院，北京 102206；2.北京農學院首都農產品安全產業(yè)技術研究院等離子體工程中心，北京 102206；3.中國農業(yè)機械化科學研究院，北京 100083)

0 引言

等離子體是由一種或幾種電子、離子、光子及處于中性的粒子所構成的部分或全電離的離子化氣體狀物質[1-2]。根據(jù)等離子產生條件，等離子體可分為高溫等離子體與低溫等離子體兩種，高溫等離子體的電子溫度和離子溫度相等，可高達10 000 K[3-4]。相比之下，低溫等離子體的電子溫度雖在10 000 K左右，但離子溫度接近環(huán)境溫度，整體上呈現(xiàn)為室溫，可直接應用于處理熱敏物質[5]。同時，低溫等離子體放電會產生大量活性氧、活性氮等活性成分，這些活性成分對細菌、真菌和孢子均有一定滅活作用，可應用于食品殺菌、農業(yè)育種和污染治理等領域[6-11]。

低溫等離子放電具有多種產生方式，包括滑動弧放電、介質阻擋放電(DBD)、等離子體射流和電暈放電等[12-17]。因激發(fā)方式不同，等離子體產生的活性粒子種類和抑菌效果具有較大差異。目前大氣等離子體放電模式主要有DBD放電、等離子體射流和滑動弧放電。MENDES-OLIVEIRA G等[18]采用DBD方式對枯草芽孢桿菌處理120 s，滅活效果超過了6個對數(shù)值，并且通過試驗發(fā)現(xiàn)導致孢子失活的主要活性氣體為臭氧。HUANG Y H等[19]采用DBD方式對枯草芽孢桿菌滅活，發(fā)現(xiàn)芽孢失活率取決于初始芽孢濃度和芽孢的處理時間，但對等離子體中活性物質的組分缺乏深入研究。ROTH S等[20]采用DBD方式滅活枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)紫外線輻射在孢子失活過程中起主導作用，并且枯草芽孢桿菌的孢子是通過蛋白質失活和DNA損傷的共同作用而被滅活的。由此可知，介質阻擋放電的優(yōu)勢是放電面積較大，殺菌的主要活性成分為臭氧離子，而等離子體射流產生活性物質更加復雜。HERTWIG C等[21]采用射頻等離子射流設備對枯草芽孢桿菌進行滅活，發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)殺菌作用的活性物質為活性氧。REINEKE K等[22]采用純氬氣作為等離子體射流設備的氣源，通過放電處理5 min后能降低芽孢桿菌約3個對數(shù)值，向純氬氣中通入一定比例的氧氣與氮氣能有效增強紫外光的發(fā)射強度。HONG Y F等[23]使用氦氣與氧氣的混合氣體作為等離子體射流設備的氣源，在放電40 s時滅活大腸桿菌約6個對數(shù)值，放電120 s后能減少枯草芽孢桿菌約5個對數(shù)值，證明了氧自由基(ROS)對細菌具有較強滅活性。PINA-PEREZ M C等[24]采用表面微放電裝置對枯草芽孢桿菌進行了滅活，在等離子體功率5 mW/cm2時需要放電處理7 min才能降低約4個對數(shù)值。

相較于DBD和等離子體射流放電等離子體，滑動弧放電作為一種介于熱等離子體和冷等離子體之間的溫性等離子體，兼具熱等離子體和冷等離子體的特性，具有裝置成本低、結構簡單、應用靈活和容易控制等特點，具有較高離子電離率和抑菌效率[25-28]。MOREAU M等[29-30]采用滑動弧放電方式進行殺菌工藝探索，結果表明，滑動弧放電殺菌具有多個階段，前期放電過程中活細菌數(shù)量較穩(wěn)定，在30 s內存活細菌數(shù)量會迅速減低10個對數(shù)值，但對滑動弧放電的殺菌機制缺少系統(tǒng)研究。由此可見，等離子體因激發(fā)模式的不同，會導致殺菌效率存在差異，對應的殺菌機制更加復雜。相對其他放電模式，滑動弧放電在放電面積和殺菌效率方面具有一定優(yōu)勢，現(xiàn)階段對于滑動弧放電殺菌機理與活性有效成分的鑒別不夠全面，本研究采用滑動弧放電等離子體放電處理枯草芽孢桿菌，通過改變輸入氣體的組分來探究滑動弧放電等離子體的殺菌效果與機理，明確其主要殺菌成分，為滑動弧等離子體的研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCCIC10275)，北京農學院食品學院微生物實驗室；胰蛋白胨、酵母浸粉，華中海威(北京)基因科技有限公司；平板計數(shù)瓊脂(PCA)，北京奧博星生物技術有限責任公司；叔丁醇(分析純)、戊二醛，國藥集團化學試劑有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

滑動弧放電等離子體裝置，實驗室自制；PG-1000ZF型等離子體電源(南京蘇曼等離子科技有限公司)；JEOL JSM-6700F型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社，JEOL)；HQ30d型便攜式數(shù)字化多參數(shù)分析儀(美國哈希公司，HACH)；FV1000MPE型多光子激光掃描顯微鏡(日本奧林巴斯，Olympus)；FACS Aria Ⅲ型六激光十八色流式細胞分析分選系統(tǒng)(美國碧迪公司，BD)。

1.3 試驗方法

1.3.1滑動弧放電設備

滑動弧放電等離子體裝置主要由等離子體反應器(兩個長度95 mm、直徑4 mm的平行銅電極和外包陶瓷管)和可調節(jié)功率交流高壓電源組成，搭建的試驗設備如圖1所示。電源輸入工作頻率50 Hz，兩電極間距1.0 cm，接入電源后，氣體(空氣、氧氣和氮氣)從陶瓷管頂部進入通電的兩電極之間形成弧光放電羽狀區(qū)(放電面積100 mm×50 mm)。

1.等離子體電源 2.高壓線 3.氣體流量計 4.氣瓶 5.空氣壓縮機 6.陶瓷管 7.等離子體羽輝 8.等離子體射流 9.銅電極圖1 滑動弧放電等離子體裝置Fig.1 Gliding arc discharge plasma device

1.3.2枯草芽孢桿菌菌懸液制備

枯草芽孢桿菌(CCIC10275)凍干粉標準菌株在無菌條件下經(jīng)菌株復溶、復壯和傳代各步驟得到第3代培養(yǎng)菌，用無菌的甘油與去離子水1∶1混合液在-20 ℃保藏菌種。每次使用前，將此菌種以1%～2%的接種量接種至PCA液體培養(yǎng)基(0.5 g胰蛋白胨、0.25 g酵母浸粉、0.1 g葡萄糖和100 mL去離子水)，于水浴恒溫振蕩器37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12～18 h直至對數(shù)生長期，此時采用無菌生理鹽水梯度稀釋至103后由平板計數(shù)法測定得出[31-32]。

1.3.3滑動弧放電處理

移取100 μL的枯草芽孢桿菌菌懸液至裝有20 mL PCA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無菌三角涂布棒均勻涂布至完全變干，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用記號筆標記菌種名稱、氣體種類、處理時間及制備日期。同時使用85%生理鹽水對原枯草芽孢桿菌菌懸液進行10、102、103和104梯度稀釋、計數(shù)。每組處理結果取3個平行的平板平均值。將上一步制備好的枯草芽孢桿菌樣品放置在距滑動弧放電裝置放電下方1～2 cm處，分別將3種氣體(空氣、氮氣和氧氣)的流量調節(jié)為0.3 L/min，調整放電功率800 W，對枯草芽孢桿菌進行不同時間(0、5、10、15、20和25 s)的滅菌處理。

1.3.4菌落總數(shù)測定

將上述處理完的培養(yǎng)皿倒置于恒溫(37±0.1 ℃)培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，依據(jù)GB 4789.2—2010菌落總數(shù)測定法中平板計數(shù)法對菌落總數(shù)進行計數(shù)[32]。

1.3.5掃描電鏡樣品前處理

將枯草芽孢桿菌菌懸液進行多次0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗脫離心處理(8 000 r/min離心3 min、溫度4 ℃)，沉淀物涂于無菌載玻片上自然晾干，置于不同氣體的滑動弧放電中進行滅活處理，處理后的枯草芽孢桿菌樣品用0.1 mol/L PBS進行沖洗收集，獲得的收集液采用相同參數(shù)離心處理，將離心所得沉淀物加入400 μL戊二醛溶液在-4 ℃條件下固定12～16 h[33]。固定后的樣品使用0.1 mol/L PBS進行3次洗滌，將1%的鋨酸和0.1 mol/L PBS混合液與洗滌后樣品混合染色固定2 h，重復3次PBS緩沖液洗滌，進行多次乙醇梯度脫水(乙醇的體積比例分別為10%、30%、50%、70%、90%、95%、100%和100%)[34]。脫水后樣品采用叔丁醇3次置換處理，通過冷凍干燥機干燥成粉后電鍍噴金，采用電子顯微鏡分析處理。

1.3.6電導率測試樣品前處理

將枯草芽孢桿菌菌懸液進行多次0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫離心處理(10 000 r/min離心5 min、溫度4 ℃)，沉淀物涂于無菌載玻片上自然晾干，置于不同氣體的滑動弧放電裝置中進行處理，將處理后枯草芽孢桿菌樣品用1 mL(0.1 mol/L)PBS進行沖洗收集，并用無菌水定容至20 mL，采用電導儀對定容后的菌液進行電導率測定。

1.3.7激光共聚焦激光掃描顯微鏡樣品前處理

將上述制備好的枯草芽孢桿菌菌懸液進行多次0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗脫離心處理(5 000 r/min離心5 min、溫度4 ℃)，沉淀物涂于無菌載玻片上自然晾干，置于不同氣體的滑動弧放電裝置中進行滅活處理，處理后的枯草芽孢桿菌樣品用0.1 mol/L PBS進行沖洗收集，獲得的收集液采用相同參數(shù)離心處理2～3次，將離心所得沉淀物分別加入100 μL Binding buffer、5 μL V-FITC探針和10 μL PI探針，混勻后避光反應靜置15 min再加入400 μL Binding buffer，濾膜過濾上機處理。

2 結果與討論

2.1 滅菌效果

為分析不同的放電氣體對枯草芽孢桿菌的殺菌效果，采用3種不同氣體(空氣、氧氣和氮氣)來確定殺菌的有效性和差異性。通過改變放電時間形成放電等離子體處理枯草芽孢桿菌，結果如圖2所示。由圖2可知，不同放電氣體對枯草芽孢桿菌的殺菌效果差異較大?？諝夥烹姷臍⒕Ч畈?，隨著殺菌處理時間延長至25 s時，菌落總數(shù)從3.9 cfu/mL降低至0.3 cfu/mL。氧氣的殺菌效果相對較好，在殺菌處理時間至25 s時菌落總數(shù)最大可降至0 cfu/mL。氮氣的殺菌效果最好，在殺菌處理時間至20 s時菌落總數(shù)可降低至0 cfu/mL，降低了約4個log值。結果表明，處理時間越長，殺菌率越高、殺菌效果越明顯。

圖2 不同氣體處理對枯草芽孢桿菌的殺菌效果隨放電時間的變化Fig.2 Inactivation effects of Bacillus subtilis with discharge time under different gas treatment

2.2 表面形貌

不同氣體放電處理后，枯草芽孢桿菌的表面形貌如圖3所示。未處理樣品表面較為光滑，沒有褶皺和缺陷，成完整桿狀結構，如圖3a、3d和3g所示。與對照組相比，經(jīng)空氣放電處理10 s后少數(shù)枯草芽孢桿菌出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，如圖3b所示。在空氣放電處理25 s時，絕大多數(shù)枯草芽孢桿菌出現(xiàn)孢子結構的破碎與缺陷，桿狀結構被破壞，如圖3c所示。當放電氣體改為氧氣或氮氣時，在放電處理10 s后多數(shù)枯草芽孢桿菌表面出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，氮氣處理組個別枯草芽孢桿菌甚至出現(xiàn)破碎現(xiàn)象，如圖3e、3h所示。當放電時間延長至25 s時，枯草芽孢桿菌桿狀結構被大量破壞，原有結構被完全破碎，如圖3f、3i所示。不同氣體所導致的枯草芽孢桿菌表面形貌存在一定差異，這可能是由于不同氣體放電形成的活性成分不同所致，造成細胞膜結構的破裂可能是由于·OH自由基團對細胞膜脂類物質的強氧化性造成的[30]。

圖3 等離子體處理前后枯草芽孢桿菌表面形貌Fig.3 Representative SEM images of Bacillus subtilis before and after plasma treatment

2.3 菌液電導率

不同種類放電氣體形成的等離子體處理，對枯草芽孢桿菌菌液電導率的變化影響如圖4所示。氧氣和空氣等離子體處理枯草芽孢桿菌菌液電導率的結果差別相對較小，但電導率都在處理10 s前有不同程度的增長，10～25 s內電導率出現(xiàn)連續(xù)下降，在25 s時達到最小值537.5 μs/sm。對枯草芽孢桿菌菌液電導率影響最大的氣體是氮氣，在等離子體處理10 s后，枯草芽孢桿菌菌液電導率達到最大值820 μs/sm，其電導率相較于初始時電導率增加了254.5 μs/sm。

圖4 不同氣體的等離子體處理前后菌液電導率的變化Fig.4 Conductivity variation of bacterial solution before and after plasma treatment under different gas treatment

結合圖3等離子體處理25 s時的掃描電鏡圖像可知，電導率的變化趨勢在初始階段呈現(xiàn)上升現(xiàn)象，可能原因是來自等離子體放電中的活性物質對細胞膜產生了一定氧化刻蝕作用，隨處理時間增加而增強。當處理時間超過10 s后，滑動弧放電產生了熱量積累效應，在破壞細胞膜的同時也導致胞內物質的過快蒸發(fā)而損失，從而降低了菌液的電導率[35]。

2.4 細胞凋亡

為深入了解等離子體放電對枯草芽孢桿菌的殺菌機理，對樣品進行了激光共聚焦顯微鏡分析，檢測結果如圖5所示(a、b和c為對照組樣品，d、e、f/g、h、i為處理組樣品，處理時間分別為10 s和25 s)。當細胞處于活性階段時，F(xiàn)ITC和PI探針無法對其細胞膜內側磷脂酰絲氨酸進行染色標記，因此在激光共聚焦顯微鏡照射中無熒光反應。但在早期凋亡的細胞中的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)從細胞膜內側翻轉至細胞膜表面，此時PS就會與FITC探針進行高親和力結合，在激光共聚焦顯微鏡照射中呈綠色熒光反應，而凋亡晚期或壞死的細胞由于細胞膜的不完整性，會被另一種探針PI探針染色，在激光共聚焦顯微鏡照射中呈紅色熒光反應。

未經(jīng)過等離子體處理的枯草芽孢桿菌在FITC和PI探針雙重染色后未出現(xiàn)綠色或紅色的熒光反應，證明其菌體活性強且細胞膜完整，如圖5a和5b所示。當?shù)入x子體處理10 s后，通過激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)了少量由FITC探針染色的綠色熒光反應，與較多的由PI探針染色的紅色熒光反應，證明了等離子體會導致細胞的凋亡、破壞細胞膜的完整性，如圖5d和5e所示。在等離子體處理25 s時，呈紅色熒光反應(細胞凋亡)的枯草芽孢桿菌數(shù)量明顯增多，如圖5g和5h所示。通過對比3種氣體放電處理后的紅色熒光強度與數(shù)量可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氮氣等離子體處理后的樣品凋亡率高于氧氣與空氣處理組。因此，可以推斷，滑行電弧放電會對膜的通透性和完整性造成積極破壞，導致細胞壞死。

由上述研究結果發(fā)現(xiàn)，滑動弧放電等離子體滅菌效果與滑動弧放電產生的活性成分緊密相關，如ROS/RNS類活性物質積極參與并主導了枯草芽孢桿菌的滅活，這與大多數(shù)研究結論相類似[36-37]。根據(jù)殺菌效果來看，活性氮類物質殺菌的重要性超過了活性氧物質，并且滑動弧放電所產生的活性物質會隨時間變化而增多，且主要滅活枯草芽孢桿菌的機理是以RNS為主的活性物質對枯草芽孢桿菌膜結構造成了嚴重的蝕刻和侵蝕作用，使其內部遺傳物質暴露于等離子體物質照射下導致遺傳物質被分解氧化[38-39]。

3 結束語

本文研究了滑動弧放電等離子體處理對枯草芽孢桿菌的失活效果，在氮氣、空氣和氧氣放電條件下，氮氣的殺菌效果較好，在15 s的處理時間內可降低4個對數(shù)值。通過表面形貌和電導率測試進一步分析了該技術的滅菌機理，滑動弧放電等離子體處理對細胞壁造成了氧化性刻蝕作用，導致細胞壁破損，并通過細胞流式測試進一步驗證了膜的完整性被破壞，導致細胞壞死。該技術為新型殺菌技術提供了一種新的選擇，在殺菌消毒和食品儲藏保鮮領域具有較好的應用前景。