藏北高寒草原土壤酶活性對(duì)氮添加的響應(yīng)及其影響因素

吳建波， 王小丹

(中國科學(xué)院申扎高寒草原與濕地生態(tài)系統(tǒng)觀測試驗(yàn)站； 山地表生過程與生態(tài)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院、水利部成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所， 四川 成都 610041)

氮元素作為高寒草地生態(tài)系統(tǒng)主要限制營養(yǎng)元素之一，其含量增加勢必影響土壤物質(zhì)循環(huán)過程，尤其是已經(jīng)適應(yīng)氮限制的土壤物質(zhì)循環(huán)過程[1]。從資源分配理論上來說，土壤氮含量增加會(huì)提高碳和磷相關(guān)土壤酶活性[2-3]，然而，高寒草地生態(tài)系統(tǒng)氮添加對(duì)碳水解酶和磷酸酶活性影響呈降低、提高或無影響，結(jié)論并不一致[4-8]。這可能是由于氮添加不僅影響土壤氮含量，還改變土壤pH、提高地上和地下生物量、增加植物組織氮含量、改變高寒草原植物群落組成和微生物數(shù)量與群落組成[9-15]。因此，土壤酶活性可能受到土壤氮有效性、土壤酸化以及植物和微生物群落的相互影響。

土壤氮含量增加會(huì)引起土壤酸化，改變酶分子構(gòu)象直接影響酶活性[8,16-20]；土壤氮含量增加提高水解酶的活性，通過改變酶的底物直接降低氧化酶活性[21]；土壤氮含量增加直接影響地上和地下生物量以及植物組織氮含量，間接影響土壤酶活性[8,22]；土壤氮含量增加會(huì)引起植物和微生物磷限制，植物和微生物通過增加磷水解酶活性緩解磷限制[23-25]。土壤酶活性在氮添加后發(fā)生變化進(jìn)而影響土壤養(yǎng)分循環(huán)過程[8,11,20,23-25]。因此，研究土壤酶活性對(duì)氮增加的響應(yīng)及其影響土壤酶活性主要因素，對(duì)預(yù)測土壤養(yǎng)分循環(huán)以及土壤養(yǎng)分釋放具有重要意義。本研究擬通過對(duì)高寒草原通過添加氮素模擬氮沉降，從土壤-微生物-植物系統(tǒng)分析土壤酶活性在氮添加后變化趨勢及其與環(huán)境因子相互關(guān)系，以期揭示土壤酶變化趨勢及其主要影響因子，為高寒草原土壤物質(zhì)循環(huán)過程適應(yīng)氣候變化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

氮添加試驗(yàn)在西藏自治區(qū)那曲市申扎縣中國科學(xué)院高寒草地與濕地生態(tài)系統(tǒng)觀測試驗(yàn)站開展(30°57′ N,88°42′ E,海拔4 675 m)。該區(qū)域氣候?qū)儆诟咴瓉喓畮Ц珊导撅L(fēng)性氣候，年降水量大約為298. 6 mm，降雨主要發(fā)生在5～9月，降水量的季節(jié)和年際變化非常大。申扎縣年均太陽輻射為2 915.5 h，年均溫為0.4℃，最暖月均溫為6～12℃。無霜期短，植物生長期大約120天。年平均風(fēng)速為3.8 m·s-1，冬季多大風(fēng)，8級(jí)以上大風(fēng)達(dá)104.3天[26]。土壤類型為高山草原土，土壤含沙量接近77%，土壤pH約為8.2。試驗(yàn)場地自2013年開始圍封，試驗(yàn)草地圍封前屬于中度退化。植物群落以紫花針茅(Stipapurpurea)和青藏苔草(Carexmoorcroftii)為優(yōu)勢種，昆侖蒿(Artemisiananschanica)和弱小火絨草(Leontopodiumnanum)為伴生種，植被覆蓋度大概在30%左右。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2013年6月開始，采用拉丁方區(qū)組設(shè)計(jì)，模擬氮沉降量添加氮(N)的量為0 g·m-2(CK)，2 g·m-2(N2)，5 g·m-2(N5)和 10 g·m-2(N10)，共4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，樣地共劃分24個(gè)面積均為4 m×4 m的固定樣地，樣地之間設(shè)有l(wèi) m寬的緩沖隔離帶(圖1)。用硝酸銨作為模擬氮沉降的氮源，將硝酸銨分兩次在每年的6月和7月添加，將相應(yīng)質(zhì)量的硝酸銨溶解在1 L水中，然后噴灑每個(gè)樣地內(nèi)。在CK樣地內(nèi)噴灑1 L水。

圖1 試驗(yàn)景觀圖Fig.1 The aerial map of experiment

1.3 采樣

在2017年8月中旬，在每個(gè)樣地內(nèi)選取1 m×1 m的樣方，用剪刀采集地上部植物，并收集凋落物；然后在1 m×1 m的樣方內(nèi)中間選取0.5 m × 0.5 m的樣方，用直徑6 cm土鉆，采用對(duì)角線法采集0～20 cm的土壤，用孔徑2 mm土壤篩將采集土壤中的植物根系挑出，然后將土壤混勻，取1份放入保溫箱內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室放入冰箱，4℃保存，進(jìn)行土壤理化性質(zhì)、微生物特征和土壤酶活性分析。將地上部帶回實(shí)驗(yàn)室，將其放入烘箱105℃，殺青20 min。將洗凈的根系、凋落物和殺青后的地上部放入烘箱內(nèi)，70℃烘干48 h，然后用電子天平稱重(0.01 g)。

1.4 分析測試方法

土壤pH值采用玻璃電極法按土水比1∶2.5測定[27]；土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀滴定法測定[27]；可溶性有機(jī)碳含量利用超純水浸提-有機(jī)碳分析儀(Multi N/C 3100,Analytik,Germany)測定[28]。全氮含量采用半微量凱氏定氮法測定[27]；全磷含量采用高氯酸-硫酸-鉬銻抗法比色法測定[26]；有效磷含量采用碳酸氫鈉-鉬銻抗法比色法測定[27]；銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和可溶性總氮含量采用連續(xù)流動(dòng)分析儀(AA3)直接測定[29]；土壤可溶性有機(jī)氮含量用可溶性總氮減去硝態(tài)氮和銨態(tài)氮[14]；根系纖維素和根系木質(zhì)素含量采用范式纖維素法測定[30]。纖維素酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、脲酶和中性磷酸酶活性采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌，用底物顯色后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度[31]。微生物碳和微生物氮含量采用氯仿熏蒸法測定[32]。細(xì)菌和真菌數(shù)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定[33]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

土壤酶活性對(duì)不同氮添加水平的響應(yīng)采用單因素方差分析(Duncan’s post-hoc檢驗(yàn)，P<0.05)；土壤酶活性與植物特征、土壤特征和微生物特征相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析(雙尾)。單因素方差分析和相關(guān)性分析采用軟件SPSS 21.0(SPSS,Inc.,Chicago,USA)分析。為了消除數(shù)據(jù)的不穩(wěn)定性和異方差性，將植物特征、土壤特征、微生物特征和酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對(duì)數(shù)ln(x+1)轉(zhuǎn)換，然后采用軟件Canoco 5.0 (Microcomputer Power,Ithaca,NY,USA)進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酶活性對(duì)氮添加的響應(yīng)

氮添加顯著影響了高寒草原土壤酶活性(表1)。蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性隨著氮添加濃度增加而顯著降低，纖維素酶活性從3 611.64 U·g-1顯著降到2 152.89 U·g-1(P<0.05)；蔗糖酶活性從3.17 U·g-1顯著降到1.87 U·g-1(P<0.05)，多酚氧化酶活性從21 013.98 U·g-1顯著降到13 903 U·g-1(P<0.05)，過氧化氫酶活性從3.26 U·g-1顯著降到1.84 U·g-1(P<0.05)。但是脲酶和中性磷酸酶活性隨著氮添加濃度增加而顯著增加，脲酶活性從350.92 U·g-1顯著增加到536.23 U·g-1(P<0.05)，中性磷酸酶活性從0.42 U·g-1顯著增加到0.66 U·g-1(P<0.05)。

表1 氮添加對(duì)土壤酶活性的影響Table 1 Changing of soil enzyme activitity under different amount of nitrogen addition

2.2 植物特征對(duì)氮添加的響應(yīng)

氮添加顯著影響了高寒草原植物群落特征(表2)。根系生物量和凋落物量隨著氮添加濃度增加而顯著增加，根系生物量從28.18 g·m-2顯著增加到46.36 g·m-2(P<0.05)；凋落物量從0.33 g·m-2顯著增加到6.61 g·m-2(P<0.05)。根系纖維素含量不受氮添加的影響。根系木質(zhì)素含量隨著氮添加濃度增加而顯著降低，從61.68 %顯著降低到37.48%(P<0.05)。

表2 氮添加對(duì)植物特征的影響Table 2 Changes in plant property under different amount of nitrogen addition

2.3 土壤特征對(duì)氮添加的響應(yīng)

氮添加顯著影響了部分土壤特征(表3)。土壤pH、土壤有機(jī)質(zhì)含量、土壤總氮含量和有效磷含量未顯著受到氮添加的影響。可溶性有機(jī)碳含量、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和可溶性有機(jī)氮含量隨著氮添加量的增加逐漸增加?？扇苄杂袡C(jī)碳含量從13.93 mg·kg-1逐漸增加到17.87 mg·kg-1(P<0.05)。硝態(tài)氮含量從9.16 mg·kg-1逐漸增加到26.56 mg·kg-1(P<0.05)。銨態(tài)氮含量從0.63 mg·kg-1逐漸增加到2.37 mg·kg-1(P<0.05)。可溶性有機(jī)氮含量從3.93 mg·kg-1逐漸增加到9.77 mg·kg-1(P<0.05)?？偭缀康砑雍箫@著降低，從0.43 g·kg-1逐漸降到0.41 g·kg-1(P<0.05)。

2.4 土壤酶活性與土壤理化特征相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與土壤可溶性有機(jī)碳含量呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(表4，分別為：R2=—0.995，P<0.01；R2=—0.984，P<0.05；R2=—0.988，P<0.05；R2=—0.999，P<0.01)；蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與可溶性有機(jī)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(表4，分別為：R2=—0.969，P<0.05；R2=—0.966，P<0.05；R2=—0.952，P<0.05；R2=—0.987，P<0.05)；蔗糖酶和多酚氧化酶與銨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(表4，分別為：R2=—0.952，P<0.05；R2=—0.970，P<0.05)。脲酶和中性磷酸酶活性與土壤可溶性有機(jī)碳含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(表4，分別為：R2=0.973，P<0.05；R2=0.980，P<0.05)；脲酶和中性磷酸酶活性與銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(表4，分別為：R2=0.980，P<0.05；R2=0.975，P<0.05)。

表3 土壤特征對(duì)不同氮添加水平的響應(yīng)Table 3 Changes in soil property under different amount of nitrogen addition

表4 土壤特征與土壤酶活性Pearson相關(guān)性分析Table 4 Correlationship between soil properties and soil enzyme activity by Pearson analysis

2.5 土壤酶活性與植物特征相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與凋落物量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(表5，分別為：R2=-0.975，P<0.05；R2=-0.982，P<0.05；R2=-0.970，P<0.05；R2=-0.994,P<0.01)；纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與根系木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(表5，分別為：R2=0.964，P<0.05；R2=0.957，P<0.05；R2=0.963，P<0.05)；脲酶和磷酸酶與凋落物量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(表5，分別為：R2=0.981，P<0.05；R2=0.981，P<0.05)。

表5 植物特征與土壤酶活性Pearson相關(guān)性分析Table 5 Correlationship between plant properties and soil enzyme activity by Pearson analysis

2.6 土壤酶活性與微生物特征相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與微生物碳含量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(表6，分別為：R2=-0.969，P<0.05；R2=-0.996，P<0.05；R2=-0.987，P<0.05；R2=-0.983，P<0.01)。脲酶和磷酸酶活性與微生物碳含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(表6，分別為：R2=0.990，P<0.01；R2=0.992，P<0.01)。

表6 微生物特征與土壤酶活性Pearson相關(guān)性分析Table 6 Correlationship between soil microbial properties and soil enzyme activity by Pearson analysis

2.7 土壤酶活性冗余分析

冗余分析(RDA)結(jié)果表明：第一和二排序軸累計(jì)解釋率分別為98.75%和0.72%(圖2)，RDA前2個(gè)排序軸保留了土壤酶活性數(shù)據(jù)總方差的99.47%，即各環(huán)境要素中植物特征3個(gè)因子(根系木質(zhì)素含量、根系纖維素含量和凋落物量)解釋了土壤酶活性特征的99.47%。根系木質(zhì)素含量對(duì)蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性影響較大，而凋落物量和根系纖維素含量對(duì)脲酶和中性磷酸酶活性影響較大(圖2)。

圖2 土壤酶活性與土壤、微生物和植物特征冗余分析(RDA)Fig.2 Redundancy analysis between soil enzyme activity and soil,plant and microbial properties

3 討論

3.1 氮添加對(duì)高寒草原土壤酶活性的影響

氮添加顯著影響了高寒草原土壤酶活性。蔗糖酶和纖維素酶活性在氮添加后顯著降低(P<0.05，表1)，這與在高寒草甸研究結(jié)果相一致[4-5]。從相關(guān)性分析可以看出蔗糖酶和纖維素酶與微生物碳和可溶性有機(jī)碳呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(表4，6)，這可能是由于氮添加增加植物根部生長，增加根系分泌物，微生物會(huì)優(yōu)先利用相對(duì)易分解的底物，從而減少了土壤有機(jī)質(zhì)的分解[34-38]。過氧化氫酶和多酚氧化酶活性在氮添加顯著降低(P<0.05，表1)，這與草地生態(tài)系統(tǒng)研究結(jié)果相一致[2,39]。氧化酶對(duì)木質(zhì)素降解、腐殖化、碳礦化和溶解有機(jī)碳輸出具有重要作用[40]，相關(guān)性分析表明氧化酶活性與根系木質(zhì)素含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，氮添加會(huì)降低了根系木質(zhì)素含量(P<0.05，表2)，另外氮添加增加了根系生物量和凋落物量，進(jìn)入土壤的都是新鮮的植物殘?bào)w，為酚氧化酶所利用形成腐殖質(zhì)的底物較少[41]，從而降低了氧化酶活性[42-43]。土壤脲酶活性在氮添加顯著提高(P<0.05，表1)，這與Jian等meta分析結(jié)果一致[24]。相關(guān)性分析結(jié)果表明脲酶活性與銨態(tài)氮的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。脲酶主要來自植物根系的分泌物[44]，而氮添加促進(jìn)了植株根系的生長，導(dǎo)致根系分泌物增加，增強(qiáng)脲酶活性。另外，微生物喜好低分子量的有機(jī)氮，也會(huì)增加脲酶活性[44,46]。磷酸酶活性在氮添加顯著提高(P<0.05，表1)，這與范珍珍等meta分析結(jié)果相一致[25]。相關(guān)性分析結(jié)果表明磷酸酶活性與微生物碳、可溶性有機(jī)碳和銨態(tài)氮含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，從資源分配理論來說，由于氮添加增加了植物和微生物磷的限制[47-49]，植物和微生物提高磷酸酶活性緩解磷限制[11,23,50]，增加土壤中可利用的有效態(tài)磷[4,23,39,51]。

3.2 影響高寒草原土壤酶活性的主要驅(qū)動(dòng)機(jī)制

通過對(duì)土壤酶活性與植物、微生物和土壤特征冗余分析，結(jié)果表明土壤酶活性主要受到植物特征(凋落物量、根系纖維素含量和根系木質(zhì)素含量)的影響。許多研究表明氮添加導(dǎo)致土壤pH降低，直接或間接影響土壤酶活性[8,16-20,52]。但在本研究中，土壤pH沒有顯著受到氮添加的影響(表3)，Pearson分析結(jié)果也表明土壤pH與土壤酶活性不存在顯著相關(guān)關(guān)系。因此，在氮添加后，土壤pH不是影響土壤酶活性的主要因素。

氮添加增加土壤中可利用氮素(銨態(tài)氮)含量(表3)，緩解了氮素對(duì)高寒草原植物生長的限制，根系生物量的提高會(huì)增加根系分泌物進(jìn)入土壤中[34-38]，同時(shí)顯著增加凋落物量，降低了根系木質(zhì)素含量(P<0.05，表2)，這會(huì)改變微生物對(duì)碳源的利用，優(yōu)先利用易分解的碳源和氮源[8,45-46,53-54]，導(dǎo)致纖維素酶、蔗糖酶和氧化酶活性降低[35-36,55]。根據(jù)資源分配理論，由于氮添加增加了植物和微生物的磷限制，磷缺乏會(huì)刺激植物磷饑餓反應(yīng)增加磷的吸收，促進(jìn)根系分泌物(包括有機(jī)酸、激素和化感物質(zhì)等[56-58])增加，進(jìn)而引起植物調(diào)節(jié)根系微生物組成，增加磷酸酶活性，例如通過與叢枝菌根真菌及其共生內(nèi)生菌協(xié)作來滿足磷的營養(yǎng)吸收[59-60]。

4 結(jié)論

在高寒草原生態(tài)系統(tǒng)中，氮添加5年后對(duì)土壤pH不存在顯著影響，但是緩解了植物生長氮限制。氮添加增加根系生物量、凋落物量和降低了根系木質(zhì)素含量，增加土壤中易分解的碳資源含量，這導(dǎo)致與碳相關(guān)的水解酶活性(蔗糖酶、纖維素酶活性、多酚氧化酶和過氧化氫酶)下降。根據(jù)資源分配理論，氮添加增強(qiáng)了植物和微生物生長的磷限制，導(dǎo)致磷酸酶活性增加。綜上所述，氮沉降引起的植物特征變化是導(dǎo)致土壤酶活性變異的主要因素。