白刺14-3-3基因家族的鑒定及表達(dá)分析

易 丹， 王 博， 段慧榮， 李 毅*， 王麗蓉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070； 2.青海民族大學(xué)， 青海 西寧 810000； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所， 甘肅 蘭州 730050)

1967年，Moore和Perez等從牛腦組織中分離鑒定出一種可溶異源二聚體蛋白，根據(jù)遷移率命名為14-3-3蛋白[1]。該蛋白是一個(gè)結(jié)構(gòu)高度保守的多功能蛋白家族[2]，普遍存在于真核生物中，并且是能夠識(shí)別蛋白質(zhì)磷酸化的家族之一[3]。目前為止，14-3-3基因家族在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)中被廣泛研究并發(fā)現(xiàn)其在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)、抵御脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[4]。14-3-3蛋白是蛋白質(zhì)之間相互作用的紐帶，它可以和信號(hào)蛋白直接作用，從而影響這些配體分子在亞細(xì)胞中的定位，14-3-3蛋白與H+-ATPase酶結(jié)合，可以增強(qiáng)其活性，還可以通過(guò)與激素信號(hào)途徑中的關(guān)鍵分子相互作用，發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能，以此來(lái)響應(yīng)非生物脅迫[5]。由于該家族蛋白通常在植物中可形成同源二聚體或異源二聚體，并且是組成G-box蛋白復(fù)合體的一部分，因此又被稱為G-box factor 14-3-3 homologs(GF14)或G-box regulatory factor or general regulatory factor(GRF)[6-7]。

隨著模式植物和多種作物基因組測(cè)序的完成，目前已經(jīng)從擬南芥[8]、蠶豆(Viciafaba)[9]、水稻[10]、煙草(Nicotianatabacum)[11]、大麥(Hordeumvulgare)[12]、大豆(Glycinemax)[13]、番茄(Solanumlycopersicum)[14]、棉花(Gossypiumspp)[15]中分別鑒定出15，4，8，17，5，18，12，25個(gè)14-3-3基因家族成員，且這些基因在不同的組織器官、激素及逆境脅迫下呈現(xiàn)出不同的表達(dá)規(guī)律，這些研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步深入探究14-3-3基因家族的功能具有重要意義。

白刺(Nitrariatangutorum)為蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(Nitraria)的超旱生灌木，主要分布于我國(guó)陜西北部、內(nèi)蒙古西部、寧夏、甘肅河西、青海地區(qū)。白刺極耐鹽堿和干旱，并且根系發(fā)達(dá)，有很強(qiáng)的防風(fēng)固沙能力，是西北荒漠區(qū)優(yōu)良的生態(tài)樹種[16]。同時(shí)它還兼有營(yíng)養(yǎng)、藥用、飼用等價(jià)值，具有很高的經(jīng)濟(jì)開發(fā)潛力。前人在白刺的營(yíng)養(yǎng)、藥用成分、生理生態(tài)學(xué)等方面進(jìn)行了諸多研究[17-23]，并取得一定成果。在分子生物學(xué)方面也有少量的研究報(bào)道，且主要集中在相關(guān)抗逆基因的克隆及表達(dá)分析等方面[24-26]。而有關(guān)白刺14-3-3基因家族鑒定及分析的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究基于白刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)白刺14-3-3基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及其基因在不同濃度鹽、干旱處理下的組織器官表達(dá)進(jìn)行分析，以期為揭示白刺14-3-3基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年8月23號(hào)于青海省諾木洪農(nóng)場(chǎng)采集新鮮白刺果實(shí)，并經(jīng)過(guò)處理獲得干凈的白刺種子。培養(yǎng)基質(zhì)為黃河河沙(清洗、高溫消毒后)。2019年10月9日將種子種入花盆(花盆口徑：7 cm×7 cm，底徑：5 cm×5 cm)，置于培養(yǎng)間培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：白天光照12 h，夜晚光照6 h，白天溫度26℃，夜晚溫度22℃，相對(duì)濕度60%。每3 d向花盆底部托盤中灌入蒸餾水至盆內(nèi)沙子完全浸濕。隨機(jī)選取生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的白刺幼苗進(jìn)行脅迫處理。

1.2 方法

1.2.1不同脅迫處理 2019年12月24日將植株移至1/2 Hoagland(霍格蘭)溶液中，培養(yǎng)條件同上，水中全天充氧。適應(yīng)培養(yǎng)3 d后，將材料移至處理溶液中：設(shè)定低濃度聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)(10%)、高濃度PEG(30%)兩個(gè)濃度，對(duì)白刺幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理，并設(shè)立對(duì)照組(正常培養(yǎng)條件，無(wú)處理)，在處理后2，12，24 h取樣。另外設(shè)定低濃度NaCl(200 mM)和高濃度NaCl(450 mM)兩個(gè)濃度，對(duì)白刺幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理，并設(shè)立對(duì)照組(正常培養(yǎng)條件，無(wú)處理)，在處理后2，12，24，48 h取樣。每處理每時(shí)間點(diǎn)9株苗，每3株作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別取根、莖、葉后迅速放入液氮中，后放入-80℃冰箱保存待用。

1.2.2白刺14-3-3基因家族鑒定 在本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中，我們利用注釋庫(kù)篩選的方法[27]得到了28條14-3-3基因家族相關(guān)序列，除去重復(fù)序列后，利用DNAMAN(v6.0)獲取氨基酸序列后放入Pfam(http://pfam.xfam.org/)在線軟件和NCBI的CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，通過(guò)與兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，把不含有14-3-3蛋白保守結(jié)構(gòu)域的序列剔除，最終得到的序列推測(cè)為白刺14-3-3蛋白序列，并利用白刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的CDS庫(kù)、NCBI的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&PAGE_TYPE=BlastSearch &BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab& LAST_PAGE=blastp)和ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線軟件共同預(yù)測(cè)白刺14-3-3蛋白序列CDS的完整性，對(duì)CDS不完整的序列不進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析。

1.2.3蛋白理化性質(zhì)分析 利用ExPASy在線網(wǎng)站的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析已經(jīng)鑒定出來(lái)的白刺14-3-3蛋白的(具有完整CDS)氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)和平均親水性。通過(guò)CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)在線軟件對(duì)該家族基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線軟件分別預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4多序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域的分析 利用GeneDoc軟件繪制白刺14-3-3蛋白多序列比對(duì)圖并標(biāo)注高度保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域。通過(guò)在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行motif預(yù)測(cè)分析，經(jīng)驗(yàn)證基序最多值設(shè)置為7，其余為默認(rèn)值。通過(guò)TBtools工具對(duì)導(dǎo)出的MEME文本結(jié)果完成保守基序圖的繪制與分析。

1.2.5進(jìn)化樹的構(gòu)建 首先利用ClustalW(http://www.clustal.org/)軟件將擬南芥和白刺14-3-3蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，再利用Mega 7.0軟件的鄰接(Neighbor-joining)法，構(gòu)建兩種進(jìn)化樹，一種由擬南芥和白刺14-3-3家族成員共同構(gòu)成，另外一種由白刺14-3-3家族成員單獨(dú)構(gòu)成，設(shè)置bootstrap值為1 000，其他參數(shù)默認(rèn)，進(jìn)一步利用在線軟件iTOL(https://itol.embl.de/)美化進(jìn)化樹，依據(jù)進(jìn)化樹分枝分組。

1.2.6熒光定量PCR 總RNA用RNAprep Pure Plant Kit RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP432，產(chǎn)地：北京)按照試劑盒說(shuō)明在低溫?zé)o菌條件下提取RNA。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa北京寶生物公司，貨號(hào)：RR047A，產(chǎn)地：北京)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為(20 μL)：Master Mix 10 μL，5 x PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase Free dH2O 4 μL，整個(gè)過(guò)程置于冰上操作。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。

qRT-PCR用TB Green Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa北京寶生物公司，貨號(hào)：RR820A，產(chǎn)地：北京)。使用Thermo熒光定量PCR儀(美國(guó)，型號(hào)：Step One Plus)檢測(cè)cDNA樣品的CT值。首先將cDNA稀釋10倍備用，qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus) (2X) 10 μL，cDNA模板2.5 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ddH2O 5.5 μL，ROX 0.4 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)之后采集熒光。設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。引物根據(jù)鑒定獲得的核苷酸序列，在家族成員非重疊區(qū)域，利用Primer在線軟件(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3 plus.cgi)設(shè)計(jì)。內(nèi)參基因采用EF1α基因。特異性引物序列如表1所示。反應(yīng)結(jié)束后分析各基因的溶解曲線及CT值。挑選正常條件、PEG 30% 2 h和NaCl 450 mM 24 h的白刺幼苗對(duì)這10個(gè)成員做qRT-PCR分析預(yù)試驗(yàn)，對(duì)表達(dá)量相對(duì)較高的成員進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。使用公式2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[28]。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 The primers used in qPCR

1.2.7數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差(one-way ANOVA)的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)白刺在不同處理下14-3-3基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)，利用Origin 9.0繪制柱形圖并注明各組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 白刺14-3-3基因家族的鑒定

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中共得到了28條14-3-3基因家族的轉(zhuǎn)錄組序列，剔除重復(fù)冗余的序列，進(jìn)一步利用Pfam和CDD結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件初步篩選出10條含有14-3-3蛋白保守結(jié)構(gòu)域的序列。命名規(guī)則如下：此基因家族統(tǒng)稱為“GRF”家族，取白刺拉丁學(xué)名的縮寫(Nt)作為前綴，編號(hào)參考白刺和擬南芥14-3-3成員的同源關(guān)系，同源性分析通過(guò)NCBI的Blastp數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)來(lái)完成。根據(jù)與擬南芥的同源性比對(duì)，將10條候選序列按“NtGRF+編號(hào)”進(jìn)行命名。同源性高的命名為NtGRF+編號(hào)(編號(hào)與擬南芥對(duì)應(yīng))，與擬南芥同源性較高但與其它成員有差別的命名為NtGRF+編號(hào)+like(表2、表3)，對(duì)白刺14-3-3成員CDS的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，除NtGRF12不含有完整的CDS，其他成員均含有完整的CDS(表2)。

表2 白刺14-3-3基因家族基本信息Table 2 Basic information of 14-3-3 gene family in N. tangutorum

表3 白刺14-3-3基因家族成員理化性質(zhì)Table 3 The physic-chemical characters of 14-3-3 gene family in N. tangutorum

2.2 理化性質(zhì)

從表3中可知，9個(gè)白刺14-3-3基因所對(duì)應(yīng)的編碼氨基酸的數(shù)目為212 ～ 297個(gè)，編碼蛋白理論分子量范圍是24.06 ～ 33.51 kDa，蛋白理論等電點(diǎn)為4.73～6.14，平均大小為5.17，呈酸性。蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)除NtGRF9小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余均大于40，為不穩(wěn)定蛋白。蛋白的平均親水系數(shù)小于零，證明這9個(gè)蛋白均為親水性蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示這9個(gè)成員除NtGRF11like定位于質(zhì)膜，其他成員均定位在細(xì)胞質(zhì)。

白刺14-3-3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(表4)，9個(gè)蛋白的組成均有α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈，α螺旋最多，β轉(zhuǎn)角最少。SWISS-MODEL結(jié)果顯示該家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守，主要由α螺旋構(gòu)成(圖1)。

2.3 14-3-3基因家族多序列比對(duì)及保守基序分析

對(duì)10個(gè)白刺14-3-3蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果顯示它們的一致性是63.78%，中間區(qū)域的位置高度相似，且包含14-3-3基因家族的保守結(jié)構(gòu)域(L G L A L N F S V F Y Y E I)，部分序列絕對(duì)保守(圖2中紅色方框)，N-端和C-端變異程度大。

對(duì)白刺14-3-3蛋白的保守基序進(jìn)行分析，將預(yù)測(cè)的最大值設(shè)置為20，發(fā)現(xiàn)只出現(xiàn)了7個(gè)不同的motif，再返回上一步將最大預(yù)測(cè)值設(shè)置為7，以此保證motif的完整性(圖3)。如圖4(A)所示，被分析的成員中共包含7個(gè)保守基序，不同的成員所含基序的數(shù)量和種類存在一定的差異，但相同分枝上的成員有相似的基序組合。10個(gè)成員皆包含motif1，motif2，motif5和motif6，僅NtGRF3和NtGRF3 like-3包含motif7，除NtGRF2like-2和NtGRF 3like-3以外，其余成員均含有motif4，motif1，motif2，motif5，motif6在這個(gè)10個(gè)成員中均出現(xiàn)10次，motif3出現(xiàn)9次，motif4出現(xiàn)8次，motif7出現(xiàn)2次。出現(xiàn)頻率較高的motif往往在該基因中具有重要的作用[29]。

表4 白刺14-3-3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Table 4 Prediction of the secondary structure of N. tangutorum 14-3-3 protein

圖1 白刺14-3-3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of the tertiary structure of N. tangutorum 14-3-3 protein

圖2 白刺14-3-3蛋白多序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequences alignment of N. tangutorum 14-3-3 protein

圖3 白刺14-3-3蛋白保守基序Fig.3 Conserved motifs of N. tangutorum 14-3-3 protein

圖4 白刺14-3-3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(A)及保守基序分析(B)Fig.4 Phylogenetic relationship of protein 14-3-3 in N. tangutorum (A) and conserved motif analysis (B)

2.4 14-3-3基因家族進(jìn)化樹分析

圖4(A)是由白刺14-3-3蛋白序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖中可以看出白刺14-3-3家族成員的進(jìn)化關(guān)系：最早分化出來(lái)的是NtGRF11，NtGRF 11like，NtGRF9和NtGRF9like，之后是NtGRF12，NtGRF3和NtGRF3like-3，最后是NtGRF 2like，NtGRF2以及NtGRF2like-2。用15條擬南芥14-3-3蛋白序列(AtGRF1-AtGRF15)與10條白刺14-3-3蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。由圖4可知，NtGRF2like，NtGRF2和NtGRF2like-2與擬南芥中AtGRF2，AtGRF6，AtGRF8親緣關(guān)系較近；NtGRF3和NtGRF3like-3與擬南芥AtGRF3的親緣關(guān)系最近；是AtGRF5和AtGRF7，NtGRF12獨(dú)成一枝與AtGRF12親緣關(guān)系較近；NtGRF9和NtGRF9like與AtGRF9親緣關(guān)系最近；NtGRF11和NtGRF11like與AtGRF11關(guān)系近。這與我們之前在命名時(shí)與NCBI的Blastp數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果一致。

圖5 白刺、擬南芥14-3-3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.5 The evolutionary relationship of 14-3-3 protein system of N. tangutorum and Arabidopsis thaliana

2.5 白刺14-3-3基因家族成員在脅迫處理中的表達(dá)分析

為解析白刺14-3-3基因家族成員對(duì)逆境的響應(yīng)模式，利用qRT-PCR檢測(cè)其在干旱脅迫(PEG)和鹽脅迫(NaCl)處理下的表達(dá)量。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，選取表達(dá)量相對(duì)較高的基因GRF3，GRF3like-3，GRF2like用于后續(xù)表達(dá)模式分析。

如圖6所示，在不同濃度PEG處理下，GRF3，GRF3like-3，GRF2like在各時(shí)間段均有表達(dá)，其中，GRF3在低濃度PEG(10%)處理下表達(dá)量下調(diào)，在處理后期表達(dá)量有回升，在高濃度PEG(30%)處理下，2 h表達(dá)量明顯上調(diào)且達(dá)到最高，是對(duì)照組(CK)的5.9倍，隨后表達(dá)量下調(diào)；GRF3like-3在低濃度PEG 24 h和高濃度PEG 24 h表達(dá)量分別達(dá)到最高，是對(duì)照組的1.7倍和1.67倍，在這兩個(gè)濃度下表達(dá)量都呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)；GRF2like在低濃度PEG 24 h的表達(dá)量最高，是對(duì)照組的1.67倍，在高濃度PEG 2 h表達(dá)量上調(diào)達(dá)到最高，是對(duì)照組的1.9倍，隨后下調(diào)。這3個(gè)基因在低濃度PEG的處理下，表達(dá)量都出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，在高濃度PEG下表達(dá)量沒有固定的趨勢(shì)。說(shuō)明GRF3，GRF3like-3，GRF2like參與白刺的干旱脅迫應(yīng)答，且具有各自不同的調(diào)節(jié)功能。

圖6 不同濃度PEG處理下白刺14-3-3基因家族3個(gè)代表基因的表達(dá)量Fig.6 The expression of three representative genes of N. tangutorum 14-3-3 gene family under different concentrations of PEG treatments注：A-B,不同濃度PEG處理下GRF3的表達(dá)量；C-D,不同濃度PEG處理下GRF3like-3的表達(dá)量；E-F,不同濃度PEG處理下GRF2like的表達(dá)量。不同處理之間不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)。下同Note：A-B,Expression of GRF3 under different concentrations of PEG treatment；C-D,Expression of GRF3like-3 under different concentrations of PEG treatment；E-F,Expression of GRF2like under different concentrations of PEG treatment.Bars marked with different lowercase letters showed significant difference at the 0.05 level.The same as below

如圖7所示，在NaCl不同濃度處理下，GRF3，GRF3like-3，GRF2like在各時(shí)間段均有表達(dá)。其中，GRF3在低濃度NaCl(200 mM)處理下，整體表達(dá)呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，48 h的表達(dá)量最高與對(duì)照組無(wú)顯著差異，在高濃度NaCl(450 mM)48 h表達(dá)量上調(diào)到最高，是對(duì)照組(CK)的12倍；GRF3like-3在低濃度NaCl 2 h表達(dá)量明顯上調(diào)且達(dá)到最高，是對(duì)照組的12.9倍，在這之后表達(dá)量下調(diào)，在高濃度NaCl 12 h表達(dá)量最高，是對(duì)照組的19倍，在此之后下調(diào)；GRF2like在低濃度NaCl 12 h表達(dá)量最高是對(duì)照組的5.1倍，在高濃度NaCl 12 h表達(dá)量明顯上調(diào)，到24 h表達(dá)量達(dá)到最大值，是對(duì)照組的15.5倍，隨后持續(xù)下降。說(shuō)明GRF3，GRF3like-3，GRF2like同樣參與白刺的鹽脅迫應(yīng)答，且具有各自不同的調(diào)節(jié)功能。

圖7 不同濃度NaCl處理下白刺14-3-3基因家族3個(gè)代表基因的表達(dá)量Fig 7 The expression of three representative genes of N. tangutorum 14-3-3 gene family under different concentrations of NaCl注：A-B,不同濃度NaCl處理下GRF3的表達(dá)量；C-D,不同濃度NaCl處理下GRF3like-3的表達(dá)量；E-F,不同濃度NaCl處理下GRF2like的表達(dá)量Note：A-B,Expression of GRF3 under different concentrations of NaCl；C-D,Expression of GRF3like-3 under different concentrations of NaCl；E-F,Expression of GRF2like under different concentrations of NaCl

2.6 白刺14-3-3基因家族成員的組織器官特異性表達(dá)分析

如圖8所示，GRF3，GRF3like-3，GRF2like在根、莖、葉中均有表達(dá)，但不同處理?xiàng)l件下表達(dá)存在差異。其中，GRF3在正常條件和PEG處理下，根中的表達(dá)量最高，葉中的最低，在NaCl處理下，根中的表達(dá)量和莖中的基本一致，葉中的最低；GRF3like-3在正常條件和PEG處理下，葉中的表達(dá)量最高，莖中的表達(dá)量最低，在NaCl處理下，根中的表達(dá)量最高，葉中的最低；GRF2like在正常條件下，根中的表達(dá)量最高，莖中的表達(dá)量最低，在PEG和NaCl處理下都表現(xiàn)出根中的表達(dá)量最高，葉中的表達(dá)量最低。說(shuō)明該家族基因在組織器官中存在表達(dá)差異，并且能對(duì)干旱脅迫和鹽脅迫做出響應(yīng)。

圖8 不同處理下白刺14-3-3基因家族3個(gè)代表基因組織器官的表達(dá)量Fig 8 Expression levels of three representative genes of N. tangutorum 14-3-3 gene family in tissues and organs under different treatments注：A,正常條件下GRF3在不同組織器官中的表達(dá)量；B,PEG處理下GRF3在不同組織器官中的表達(dá)量；C,NaCl處理下GRF3在不同組織器官中中的表達(dá)量；D,正常條件下GRF3like-3在不同組織器官中的表達(dá)量；E,PEG處理下GRF3like-3在不同組織器官中的表達(dá)量；F,NaCl處理下GRF3like-3在不同組織器官中的表達(dá)量；G,正常條件下GRF2like在不同組織器官中的表達(dá)量；H,PEG處理下GRF2like在不同組織器官中的表達(dá)量；I,NaCl處理下GRF2like在不同組織器官中的表達(dá)量Note：A,Expression of GRF3 in different tissues and organs under normal conditions；B,Expression of GRF3 in different tissues and organs under PEG treatment；C,Expression of GRF3 in different tissues and organs under NaCl treatment；D,Expression of GRF3like-3 in different tissues and organs under normal conditions；E,Expression of GRF3like-3 in different tissues and organs under PEG treatment；F,Expression of GRF3like-3 in different tissues and organs under NaCl treatment；G,Expression of GRF2like in different tissues and organs under normal conditions；H,Expression of GRF2like in different tissues and organs under PEG treatment；I,Expression of GRF2like in different tissues and organs under NaCl treatment

3 討論與結(jié)論

蛋白磷酸化作為一個(gè)重要的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，它存在于所有真核生物中，參與細(xì)胞分裂、分化、凋亡等多個(gè)基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。14-3-3蛋白是一類基礎(chǔ)性蛋白，它主要通過(guò)調(diào)控激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)響應(yīng)與轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控[3]。本研究中，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，初步篩選出10個(gè)白刺14-3-3基因家族成員，通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)白刺14-3-3蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)上，與在擬南芥中的規(guī)律相同[30]，說(shuō)明14-3-3蛋白的功能在不同植物中是保守的。

多序列對(duì)比與保守基序分析表明，白刺14-3-3蛋白N-端和C-端區(qū)域具有較高的變異性，其余部分均保守，這與擬南芥中的研究一致[31]。motif1，motif2，motif5，motif6在白刺14-3-3家族中高度保守，N-端和C-端的motif3，motif4和motif7產(chǎn)生了變異，motif1包含該家族的保守結(jié)構(gòu)域。這種中心區(qū)域高度保守，N-端和C-端的變化使14-3-3蛋白形成很多異構(gòu)體。N-端會(huì)影響14-3-3蛋白與不同的膜結(jié)合，C-端直接參與和靶蛋白的相互作用，每一個(gè)異構(gòu)體的N-端和C-端幾乎是獨(dú)一無(wú)二的，這是造成不同的異構(gòu)體功能特異性的基礎(chǔ)[11]。有研究表明，N-端和C-端不同的motif是14-3-3蛋白發(fā)揮其不同功能時(shí)的核心結(jié)構(gòu)[32]，本研究中白刺14-3-3蛋白的N-端與C-端有不同的motif，推測(cè)該蛋白能與眾多靶蛋白相結(jié)合而發(fā)揮重要作用。

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示白刺和擬南芥14-3-3家族成員分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ4組，分別包含了6，2，2和0個(gè)白刺14-3-3蛋白，表明白刺14-3-3家族成員之間存在廣泛的多樣性。第Ⅰ組中白刺14-3-3家族成員比Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組大大增加，說(shuō)明第Ⅰ組的成員在進(jìn)化過(guò)程中較為激烈，發(fā)生了基因加倍的情況，使得成員數(shù)目增加?；蚣颖稙榘状烫峁┝烁叩倪M(jìn)化潛能[33]。在Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組中，均有白刺和擬南芥14-3-3家族成員，推測(cè)白刺和擬南芥可能具有相似的進(jìn)化軌跡。并且同源性較高的基因可能具有相似的功能。

表達(dá)模式分析可以在一定程度上預(yù)測(cè)基因的分子功能和涉及的生命過(guò)程，本研究在PEG模擬干旱脅迫的處理下，GRF3，GRF3like-3，GRF2like參與干旱脅迫響應(yīng)，除GRF3在低濃度處理下較對(duì)照組表達(dá)量沒有上調(diào)，其他處理下3個(gè)基因的表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)，這與水稻14-3-3基因家族中GF14b，GF14c，GF14e，GF14f的研究一致[30]。在NaCl高、低濃度處理下這3個(gè)基因的表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)，這與番茄14-3-3家族中的TFT1，TFT4，TFT7和TFT10的結(jié)論一致[30]。與此同時(shí)這3個(gè)基因?qū)Φ蜐舛萈EG脅迫的響應(yīng)模式相似，表達(dá)量都是先下調(diào)后上調(diào)，均在脅迫后期響應(yīng)更明顯，而對(duì)高濃度PEG有不同的響應(yīng)模式，并且在高濃度NaCl處理下都在脅迫中后期響應(yīng)更明顯，但在低濃度NaCl處理下有不同的響應(yīng)模式，這可能跟不同基因在脅迫中承擔(dān)的功能不同有關(guān)。14-3-3家族成員在不同物種中的表達(dá)存在器官特異性，擬南芥中15個(gè)14-3-3基因只有GRF1和GRF2在所有的器官中都有表達(dá)，多數(shù)14-3-3基因的表達(dá)具有明顯的組織器官特異性，如GRF14僅在生殖器官中表達(dá)[34]。本研究中的3個(gè)基因除GRF3like-3在正常條件和PEG處理下葉片中的表達(dá)量最高，在NaCl處理下根中的表達(dá)量最高以外，剩余2個(gè)基因均在正常條件、PEG和NaCl的處理下根中的表達(dá)量最高。綜合上述結(jié)果來(lái)看，14-3-3基因家族在白刺不同組織器官中表現(xiàn)出明顯不同的表達(dá)規(guī)律，并可響應(yīng)外界的干旱和鹽脅迫。由此推測(cè)，14-3-3基因家族可能在白刺的脅迫防御方面發(fā)揮重要功能。

本研究基于白刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，初步篩選出10個(gè)14-3-3家族成員，通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)了其基因家族的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。同時(shí)，通過(guò)分析白刺14-3-3家族成員在不同濃度鹽、干旱處理下的組織器官表達(dá)特性，初步證明了14-3-3基因家族參與白刺抗旱耐鹽脅迫防御反應(yīng)過(guò)程，該結(jié)果為進(jìn)一步深入探究揭示白刺14-3-3基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。