固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)保健食品中9種人參皂苷

陳樹(shù)東, 馮 銳, 林曉佳, 梁土金, 何秋婷

(1. 廣東省中藥研究所, 廣東 廣州 510640; 2. 廣東醫(yī)科大學(xué), 廣東 東莞 523808; 3. 廣州檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司, 廣東 廣州 511447)

人參、西洋參和三七等五加科(Araliaceae)植物不僅是傳統(tǒng)的名貴中藥材,作為納入可用于保健食品管理的中藥品種,在保健食品中的應(yīng)用也非常廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì),在2006～2015年間，中國(guó)注冊(cè)的保健食品中,有近40%的保健食品含有人參、西洋參或三七成分[1]。人參皂苷是人參、西洋參和三七的主要活性化合物,對(duì)心血管系統(tǒng)[2]、免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3,4]都具有藥理作用,作為保健食品的特征成分和質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo),準(zhǔn)確檢測(cè)其含量具有非常重要的意義。人參皂苷屬于四環(huán)三萜類化合物,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的種類有50多種,主要分為原人參二醇型皂苷(PPD)、原人參三醇型皂苷(PPT)和齊墩果酸型皂苷3種類型[5]。其中,人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1和Rg2等9種化合物的含量超過(guò)90%[6,7],本文以9種主要人參皂苷成分為研究對(duì)象,旨在建立一個(gè)快速、可靠的人參皂苷檢測(cè)方法,用于保健食品中人參皂苷成分的檢測(cè)和質(zhì)量評(píng)價(jià)。

目前,人參皂苷的測(cè)定方法有高效液相色譜法(HPLC)[8-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[5,13]、液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HPLC-QTOF-MS)[14,15]、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(MEKC)[16]等,這些分析方法的研究主要集中在中藥植物或中成藥含量分析方面,通常只針對(duì)某些特定的人參皂苷化合物,針對(duì)保健食品中主要人參皂苷成分的定性定量研究鮮有報(bào)道。其中,QTOF-MS和MEKC由于儀器成本和實(shí)際應(yīng)用的限制,方法較難普及。人參皂苷的檢測(cè)主要以HPLC為主,但由于人參皂苷在紫外區(qū)的吸收較弱,在紫外吸收的臨界波長(zhǎng)下人參皂苷的響應(yīng)不高,大量的雜峰干擾也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響[17]。保健食品中添加的其他復(fù)雜成分在沒(méi)有做好合理凈化的情況下也會(huì)進(jìn)一步影響檢測(cè)結(jié)果[18]。另外,人參皂苷的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相近,在常規(guī)液相色譜法中分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[8]。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd和原人參三醇型皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)等9種人參皂苷主要成分的快速分離和準(zhǔn)確定量,結(jié)合固相萃取前處理?xiàng)l件,在復(fù)雜基質(zhì)條件下對(duì)保健食品中的人參皂苷物質(zhì)進(jìn)行提取、富集,為保健食品中的人參皂苷含量檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantum Access MAX三重四極桿質(zhì)譜儀、UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司); Sartorius BSA224S-CW電子天平(德國(guó)Sartorius公司); 5424R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司); MIX-1振蕩渦旋混合器(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司); KQ-250E超聲波水浴器(昆山市超聲儀器有限公司); Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

乙酸銨(色譜純,上海Macklin公司);甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,德國(guó)Merck公司); Alumina-N/XAD-2 SPE柱(1 g/4 g, 10 mL)和人參皂苷Rb2(批號(hào)Z99800205)、Rb3(批號(hào)Y8650010)、Rc(批號(hào)U9330025)、Rd(批號(hào)R7880050)、Rf(批號(hào)T7810020)、Rg2(批號(hào)47560010)購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;對(duì)照品人參皂甙Re(批號(hào)110754-201827)、Rg1(批號(hào)110703-201731)、Rb1(批號(hào)110704-201827)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。11批保健食品均為市售。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取各目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g,用甲醇溶解并配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃保存。分別吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇稀釋,渦旋混勻,配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-18 ℃保存。移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇-水(30∶70, v/v)配制成0.005～0.5 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

固體試樣:取片劑或膠囊內(nèi)容物研成粉末,稱取0.5 g試樣,置于50 mL塑料離心管中,加入約15 mL純化水渦旋振搖混勻,超聲提取(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,以5 000 r/min離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中,殘?jiān)?0 mL純化水分2次重新提取,提取液并入量瓶中,用純化水定容至刻度,混勻,待凈化。

液體試樣:稱取2 g試樣,置于50 mL塑料離心管中,加入約40 mL純化水,渦旋振搖混勻,超聲提取(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,用純化水定容至50 mL,混勻,待凈化。

1.3.2凈化

分別用20 mL 70%乙醇水溶液和20 mL水對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化,取2.0 mL樣品提取溶液上樣,分別用20 mL水進(jìn)行淋洗,用20 mL 70%乙醇水溶液進(jìn)行洗脫,收集洗脫液;洗脫液用甲醇-水(30∶70, v/v)定容至25.0 mL,混勻后用0.22 μm混合型濾膜過(guò)濾,上機(jī)檢測(cè)。若樣品中人參皂苷濃度超出線性范圍,用甲醇-水(30∶70, v/v)適當(dāng)稀釋。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)柱;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸), B為乙腈;流速：0.4 mL/min。梯度洗脫條件:0～4.0 min, 81%A; 4.0～6.0 min, 81%A～79%A; 6.0～8.0 min, 79%A～72%A; 8.0～15.0 min, 72%A～69%A; 15.0～20.0 min, 69%A～54%A; 20.0～20.5 min, 54%A～10%A; 20.5～22.0 min, 10%A; 22.0～22.5 min, 10%A～81A%。進(jìn)樣量:5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源,負(fù)離子模式(ESI-);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;離子傳輸毛細(xì)管溫度:350 ℃;電噴霧電壓:3 000 V;蒸發(fā)溫度:400 ℃;碰撞氣體壓力:0.2 Pa;輔助氣流量:3.6 mL/min;鞘氣流量:10.5 mL/min。9種分析物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)(Q1/Q3 ion pairs)、碰撞能量和管透鏡補(bǔ)償電壓(tube lens)見(jiàn)表1。

表 1 9種分析物的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)在ESI-和MRM模式下檢測(cè)人參皂苷,由于9種人參皂苷的主要分子結(jié)構(gòu)類似(見(jiàn)圖1),人參皂苷的電離裂解過(guò)程為皂苷分子M丟失一個(gè)質(zhì)子形成[M-H]-準(zhǔn)分子離子,準(zhǔn)分子離子在碰撞池與碰撞氣分子發(fā)生碰撞而裂解成的碎片離子也多以丟失各種糖基G后形成[M-H-G]-為主[19,20],離子形成和裂解機(jī)理基本一致,碎片離子具有各型皂苷的典型特征。原人參二醇型皂苷作為準(zhǔn)分子離子,斷裂后以m/z783.5和m/z945.5的碎片離子為主;原人參三醇型皂苷準(zhǔn)分子離子,斷裂后出現(xiàn)m/z475.5和m/z637.4為主的碎片離子。在確定了一級(jí)質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰和相應(yīng)的碎片離子后,實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)噴霧電壓、碰撞能量和管透鏡補(bǔ)償電壓等條件進(jìn)一步優(yōu)化,使得方法的靈敏度進(jìn)一步得到提升。

2.2 色譜條件優(yōu)化

圖 2 9種人參皂苷的總離子流色譜圖

由于9種人參皂苷的分子結(jié)構(gòu)相類似,通過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn),原人參二醇型結(jié)構(gòu)的人參皂苷Rb2、Rb3和Rc互為同分異構(gòu)體,分子結(jié)構(gòu)相同,只是在空間結(jié)構(gòu)上存在差別,3種物質(zhì)的一級(jí)準(zhǔn)分子離子峰和裂解失去糖基后形成的離子碎片均相同(m/z1 077.6/783.5、m/z1 077.6/945.5),且在色譜柱上的保留時(shí)間接近,因此在色譜分離時(shí),這3種物質(zhì)需達(dá)到完全分離才能準(zhǔn)確定量。研究采用Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm),在0.4 mL/min的流速條件下,通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫條件,使人參皂苷Rb2、Rb3和Rc 3種目標(biāo)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)完全分離,全部9種目標(biāo)物質(zhì)均實(shí)現(xiàn)較好的分離效果(見(jiàn)圖2)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了相同梯度洗脫條件下甲醇-水和乙腈-水體系流動(dòng)相對(duì)9種目標(biāo)物質(zhì)的分離效果,結(jié)果表明,乙腈-水體系流動(dòng)相的洗脫能力優(yōu)于甲醇-水體系,且峰形對(duì)稱性更好。在質(zhì)譜條件優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),在乙腈-水流動(dòng)相體系中加入甲酸能夠提高皂苷物質(zhì)的響應(yīng)信號(hào),另外,添加一定比例的乙酸銨,也能改善流動(dòng)相的洗脫能力和部分目標(biāo)物質(zhì)的峰形。經(jīng)過(guò)對(duì)乙酸銨和甲酸加入量的優(yōu)化,最終確定采用5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)-乙腈流動(dòng)相作為實(shí)驗(yàn)最終條件,能獲得更好的洗脫能力和信號(hào)強(qiáng)度。

表 2 采用不同固相萃取柱時(shí)9種人參皂苷的基質(zhì)效應(yīng)和回收率

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1固相萃取柱的選擇

保健食品成分相對(duì)復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的凈化和富集。在傳統(tǒng)的SPE提取凈化方法中,C18固相萃取柱[21]和HLB固相萃取柱[22]是常用的固相萃取柱類型。為考察不同固相萃取方式對(duì)復(fù)雜樣品凈化效果的影響,實(shí)驗(yàn)以膠囊樣品為研究對(duì)象,以基質(zhì)效應(yīng)(ME)的大小和樣品的回收率為指標(biāo),對(duì)C18、HLB、Alumina-N/XAD-2 3種不同固相萃取柱的凈化效果進(jìn)行比較(見(jiàn)表2)。其中,基質(zhì)效應(yīng)以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的響應(yīng)值與系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中相應(yīng)濃度點(diǎn)的響應(yīng)值的比值計(jì)算,ME值越接近100%,表明基質(zhì)效應(yīng)越低。結(jié)果表明,經(jīng)Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge復(fù)合固相萃取柱凈化后,9種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)明顯低于C18和HLB柱凈化后,回收率與另外兩種萃取柱相比也有一定的優(yōu)勢(shì)。

2.3.2提取溶劑、淋洗和洗脫劑的選擇

研究采用Alumina-N/XAD-2復(fù)合固相萃取柱作為前處理的凈化柱,柱填料分別為XAD-2大孔吸附樹(shù)脂和中性氧化鋁,XAD-2大孔樹(shù)脂是一種適用范圍廣泛的固相萃取填料,通過(guò)分子排阻作用對(duì)保健食品中的糖類、蛋白質(zhì)和添加劑進(jìn)行洗脫[23],中性氧化鋁填料能夠?qū)υ碥疹悺ⅫS酮類水溶性成分或極性化合物有較強(qiáng)的吸附能力[24],兩種不同填料的復(fù)合使用能夠?qū)δ繕?biāo)物質(zhì)進(jìn)行富集并與其他干擾物質(zhì)分離。水飽和的正丁醇溶液或甲醇水溶液是常見(jiàn)的人參皂苷提取劑,在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn),正丁醇或甲醇會(huì)洗脫固相萃取小柱XAD-2填料表面吸附的人參皂苷成分,需要在固相萃取上柱前先蒸干除去提取液中的醇類,再進(jìn)行固相萃取富集和提取。實(shí)驗(yàn)以水飽和正丁醇溶液、甲醇-水(50∶50, v/v)溶液和純水為提取溶液,分別對(duì)含有9種人參皂苷的保健食品進(jìn)行提取,比較3種提取溶液的提取效率。結(jié)果表明,3種不同提取溶液對(duì)9種人參皂苷的提取效率基本一致,說(shuō)明純水可以對(duì)人參皂苷進(jìn)行有效提取。因此,選擇純水作為提取溶劑。

另外,洗脫劑的選擇和用量是前處理的關(guān)鍵,選擇最佳洗脫劑需要兼顧人參皂苷的洗脫率、雜質(zhì)洗脫率以及洗脫劑的用量。大孔樹(shù)脂洗脫時(shí)常用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,乙醇的體積分?jǐn)?shù)和洗脫體積對(duì)待分離成分的含量具有較大的影響[25]。通過(guò)提高洗脫液中乙醇的比例能夠使填料中吸附的人參皂苷逐漸被洗脫,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫劑中乙醇比例達(dá)到70%時(shí),人參皂苷基本能夠完全洗脫,故選擇采用70%乙醇作為洗脫劑。方法考察了不同體積(5～30 mL)洗脫劑對(duì)人參皂苷提取率的影響(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明,洗脫劑達(dá)到20 mL時(shí),基本能使人參皂苷完全洗脫。

圖 3 不同體積的洗脫劑對(duì)9種人參皂苷提取率的影響

表 3 9種人參皂苷的線性方程、相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍與檢出限

在優(yōu)化后的色譜條件下,考察了9種人參皂苷在0.005～0.5 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系,以各分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以其相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo),得到各自的線性方程。結(jié)果顯示,9種人參皂苷在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 3～0.999 4。9種目標(biāo)物在液體樣品和固體樣品中的定量限分別為2.5 mg/kg和10 mg/kg。該法靈敏度較高,可較好的應(yīng)用于保健食品中9種人參皂苷的檢測(cè)。

2.4.2回收率與精密度

按照確定的前處理方法,對(duì)保健食品基質(zhì)進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),添加水平為定量限的1、6和12倍,每個(gè)添加水平重復(fù)6次,計(jì)算回收率和精密度。結(jié)果表明，9種人參皂苷的回收率為81.1%～114.2%,精密度為0.4%～8.0%(見(jiàn)表3)。說(shuō)明方法可滿足實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)的要求。

2.4.3穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)考察了9種人參皂苷經(jīng)提取后,在樣品瓶中放置1、4、8、12、24、48 h后的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,9種人參皂苷含量的RSD值≤8.66%,說(shuō)明該條件下樣品的穩(wěn)定性良好,能滿足測(cè)定要求。

2.4.4基質(zhì)效應(yīng)

分別選取3種代表性基質(zhì)(片劑、膠囊和口服液)的保健食品,采用1.3節(jié)的前處理方法,比較了3種代表性樣品基質(zhì)對(duì)9種人參皂苷測(cè)定的影響。結(jié)果顯示,9種人參皂苷的基質(zhì)效應(yīng)在片劑樣品、膠囊樣品和口服液樣品中分別為92.2%～102.3%、89.6%～95.3%和93.3%～105.1%。說(shuō)明樣品基質(zhì)經(jīng)過(guò)前處理過(guò)程的凈化和較大體積的稀釋,基質(zhì)效應(yīng)對(duì)化合物的影響較小,采用甲醇-水(30∶70, v/v)溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液能夠滿足測(cè)定要求。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用所建立的方法分別對(duì)市售11批保健食品進(jìn)行分析,其中6批原材料標(biāo)識(shí)含有人參、西洋參、三七等五加科植物成分(樣品1-6), 5批未標(biāo)識(shí)含有人參、西洋參、三七等五加科植物成分(樣品7-11),分別按照優(yōu)化后的前處理和分析條件處理,結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4 保健食品樣品中9種人參皂苷成分的測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明,標(biāo)識(shí)含有五加科植物配料的6批保健食品均檢出人參皂苷成分,9種人參皂苷含量占0.56%～2.68%,與樣品標(biāo)簽標(biāo)注總皂苷含量接近;有1批配料表僅標(biāo)識(shí)葛根提取物、苦瓜提取物等成分的保健食品檢出包括人參皂苷Rf在內(nèi)的9種人參皂苷成分(樣品8), 9種人參皂苷含量占0.46%;另外4批未標(biāo)識(shí)含有五加科植物成分樣品均未檢出9種人參皂苷。

3 結(jié)論

本文建立了一種快速、高效分析保健食品中9種人參皂苷的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該法能快速測(cè)定人參提取物中9種人參皂苷的含量,通過(guò)對(duì)色譜和質(zhì)譜參數(shù)、樣品提取和凈化方式、淋洗和洗脫劑等條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,該方法快速準(zhǔn)確,靈敏度高,重復(fù)性好,實(shí)用性強(qiáng),為保健食品中人參皂苷的檢測(cè)及質(zhì)量控制提供了可靠的技術(shù)支持。