超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析尿液中色氨酸及其代謝產(chǎn)物

李 慧, 崔蘭沖, 章國(guó)磊, 張萌萌, 焦麗麗, 吳 巍*

(1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué), 吉林省人參科學(xué)研究院, 吉林 長(zhǎng)春 130117; 2. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130117)

色氨酸(Trp)又稱α-氨基β-吲哚丙酸[1],是人體必需的氨基酸之一[2]。人體每天需要的Trp來(lái)自內(nèi)源蛋白質(zhì)的分解和食物的消化吸收,這些Trp除用于蛋白質(zhì)生物合成外,主要在肝、腎、腦等組織器官發(fā)生代謝[3,4]。Trp會(huì)在吲哚胺-2,3-雙加氧酶、單胺氧化酶、犬尿甲酰胺酶等的作用下通過(guò)Trp-5-羥色胺(5-HT)和Trp-犬尿氨酸(Kyn)兩條主要途徑降解并排出體外[5,6]。受機(jī)體飲食、活動(dòng)量以及機(jī)體狀態(tài)的影響,每天攝入的Trp以及參與代謝的酶會(huì)發(fā)生變化,這些細(xì)小的變化如果逐漸積累放大,就會(huì)造成機(jī)體代謝狀態(tài)的差異,最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究表明,腫瘤、感染性疾病、神經(jīng)性疾病等均伴隨發(fā)生Trp的代謝紊亂[7,8],了解Trp及其代謝產(chǎn)物在正常個(gè)體日常狀態(tài)下的排泄規(guī)律對(duì)Trp相關(guān)疾病的普查、健康狀態(tài)的監(jiān)測(cè),以及疾病的早期診斷都具有重要意義。

Trp及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)含量低,檢測(cè)難度較大。近年來(lái),利用Trp及其代謝產(chǎn)物的紫外、熒光、電化學(xué)性質(zhì),可以采用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)[9]、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)[10]和高效液相色譜-質(zhì)譜法[11](HPLC-MS)等。其中HPLC-MS由于其高度特異性及準(zhǔn)確性成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[12]。然而,現(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于Trp及其代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道多集中在疾病個(gè)體和正常個(gè)體的區(qū)分,如Cheng等[13]發(fā)現(xiàn)腎功能不全患者血漿Trp和其代謝產(chǎn)物的含量較高;Heilman等[14]發(fā)現(xiàn)血液中Trp及其代謝產(chǎn)物含量可以用于評(píng)估帕金森患者病情;吳智明等[15]發(fā)現(xiàn)大腸癌患者尿液Kyn與Trp比值較對(duì)照組顯著提高。這些報(bào)道研究多采用多時(shí)間點(diǎn)收集的尿液進(jìn)行檢測(cè)和比較,并不能反映某一時(shí)間點(diǎn)機(jī)體代謝產(chǎn)物的含量情況。Trp的吸收和排泄是正常機(jī)體每天都需要進(jìn)行的生理過(guò)程,受食物攝入和活動(dòng)量變化的影響較大[16]。了解健康志愿者隨機(jī)尿樣中Trp及其代謝產(chǎn)物的水平是Trp等相關(guān)代謝產(chǎn)物用于疾病診斷的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS),采用丹磺酰氯(DNS-Cl)柱前衍生化技術(shù)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行衍生,建立了Trp及其代謝產(chǎn)物的定量分析方法,并應(yīng)用該方法研究了健康志愿者隨機(jī)尿樣中Trp及其代謝產(chǎn)物的含量,探索其在尿液中的排泄規(guī)律,為臨床疾病的診斷提供理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000型超高效液相色譜系統(tǒng)、TSQ Endura三重四極桿質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó)); AG 22331低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó)); MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特賽斯儀器有限公司,中國(guó)); SQP電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司,中國(guó)); RCT-3200超純化水機(jī)(萊博帕特科技發(fā)展有限公司,中國(guó))。

3-OH-犬尿氨酸(3-OH-Kyn,純度98%)(美國(guó)Sigma公司)、Trp(純度>98.0%)、5-HT(純度>98.0%); 3-OH-鄰氨基苯甲酸(3-OH-AA,純度98%,上海麥克林生化科技有限公司);黃尿酸(XA,純度>96.0%,梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司);犬尿喹啉酸(KA,純度>98.0%,上海源葉生物科技有限公司); Kyn(純度>98.0%,阿拉丁試劑(上海)有限公司); 5-羥吲哚乙酸(5-HIAA,純度>98.0%,美國(guó)Alfa Aesar公司);肌酐(Cr,純度>98.0%,上海源葉生物科技有限公司);內(nèi)標(biāo)咖啡酸(CA,純度99.9%,日本TCI公司); DNS-Cl純度99%,北京百靈威科技有限公司);甲醇、甲酸、乙腈(色譜純,美國(guó)Tedia公司)。

尿液樣本的采集對(duì)象為吉林省長(zhǎng)春市的7名健康男性,年齡為20～22歲,所有參與志愿者在采樣前均詳細(xì)閱讀并簽署了知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱:Thermo C18色譜柱(50 mm×3 mm, 2.7 μm);柱溫:35 ℃;樣品室溫度:4 ℃;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水溶液,B為甲醇;流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～3.0 min, 30%B; 3.0～9.0 min, 30%B～95%B; 9.0～12.0 min, 95%B; 12.0～12.5 min, 95%B～30%B; 12.5～17.0 min, 30%B。進(jìn)樣量:2 μL。

采用電噴霧電離方式進(jìn)行離子化,正離子、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式掃描。掃描范圍:m/z100～1 000;噴霧電壓:4 000 V;鞘氣壓力:6.125 MPa;輔助氣壓力:0.875 MPa;傳輸毛細(xì)管溫度:350 ℃;霧化器溫度:300 ℃;針泵進(jìn)樣。數(shù)據(jù)采用Thermo Xcalibar軟件進(jìn)行分析。待測(cè)物的碰撞能量(CE)、RF透鏡電壓(RF lens)和其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.2.2樣品的收集與處理

于每天11∶00～13∶00在潔凈容器中收集中段尿液10 mL,取1 mL,加入100 μL 1%甲酸水溶液,混勻后,以5 000 r/min離心10 min,取上清200 μL,于-80 ℃避光冷凍,備用,分析時(shí),尿樣于4 ℃下解凍。

向尿液樣品中加入50 μL 100 μg/mL的CA和含8 mg/L DNS-Cl的乙腈溶液200 μL,混勻,加入400 μL 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液,渦旋,于60 ℃金屬浴加熱20 min。再次向反應(yīng)體系中加入16 μL 0.5 mol/L三乙胺溶液。反應(yīng)30 min后加入15%甲酸水溶液16 μL,終止反應(yīng),過(guò)0.22 μm微孔濾膜,備用。衍生反應(yīng)的結(jié)構(gòu)通式見(jiàn)圖1。

表 1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)

圖 1 丹磺酰氯的衍生反應(yīng)

配制含有3.0 mmol/L MgCl2·6H2O、3.8 mmol/L CaCl2·2H2O、14.5 mmol/L Na2SO4、72.1 mmol/L NaCl、2.2 mmol/L C6H5Na3O7·2H2O、18.7 mmol/L KH2PO4、0.15 mmol/L Na2C2O4、19.3 mmol/L KCl、17.2 mmol/L NH4Cl、41.6 mmol/L 尿素和9.3 mmol/L Cr的人工尿樣(pH=7.4)模擬空白基質(zhì)。在空白基質(zhì)中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為質(zhì)控(QC)樣本用于監(jiān)控分析序列的重復(fù)性和穩(wěn)定性,處理方法同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的化合物含有氮原子,相對(duì)分子質(zhì)量較小,在正離子掃描模式下,[M+H]+強(qiáng)度很弱,難以檢測(cè),且易發(fā)生源內(nèi)裂解,檢測(cè)難度較大。同時(shí),由于極性原因,目標(biāo)化合物與尿液中強(qiáng)極性化合物一同流出,基質(zhì)效應(yīng)較大。本實(shí)驗(yàn)以丹磺酰氯為衍生化試劑,采用柱前衍生的方法對(duì)尿液中Trp及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行衍生。

丹磺酰氯是一種強(qiáng)熒光劑,基團(tuán)上的磺?；軌蚺c伯胺、仲胺以及酚羥基發(fā)生取代反應(yīng),提高化合物的相對(duì)分子質(zhì)量,同時(shí)丹磺酰氯衍生后還可以改善待測(cè)物的極性,延長(zhǎng)保留時(shí)間,提高檢測(cè)靈敏度。待測(cè)物的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

圖 2衍生產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 方法學(xué)考察

待測(cè)化合物屬于內(nèi)源性物質(zhì),本研究依據(jù)《中國(guó)藥典》(2015版)中“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”,采用人工尿樣作為空白基質(zhì),向其中添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,考察了方法的專屬性、線性范圍、精密度、穩(wěn)定性和回收率。

2.2.1專屬性

精密量取人工尿液樣本,加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,建立空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。按1.2.2節(jié)處理空白人工尿液和實(shí)際尿液,并將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入人工尿液中,分別得到空白人工尿液、實(shí)際尿液和加標(biāo)尿樣的提取離子流色譜圖(見(jiàn)圖3)。

圖 3 衍生產(chǎn)物的提取離子流色譜圖

表 2 目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、回收率和精密度

通過(guò)提取離子流色譜圖分析可知,人工尿液中只有Cr峰,而無(wú)其他目標(biāo)化合物(見(jiàn)圖3a),圖3b中待分析物的保留時(shí)間與圖3c中標(biāo)準(zhǔn)品一致。說(shuō)明本方法的專屬性良好。

2.2.2線性范圍與檢出限

在優(yōu)化后的條件下對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,并以濃度為橫坐標(biāo)、目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)(CA)峰面積比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,8種目標(biāo)化合物各自范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.974 0。檢出限(LOD)以3倍的信噪比計(jì)算,8種目標(biāo)化合物的LOD為0.005～0.5 ng/mL(見(jiàn)表2)。

2.2.3回收率和精密度

在空白基質(zhì)(人工尿樣)中分別添加高、中、低3種不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行方法回收率的驗(yàn)證,各目標(biāo)化合物加標(biāo)水平見(jiàn)表2。結(jié)果表明,目標(biāo)化合物的回收率為93.24%～107.65%。每種水平各6份,連續(xù)測(cè)定3 d,計(jì)算日內(nèi)和日間精密度,結(jié)果分別為0.51%～3.12%和0.51%～3.59%。

2.2.4穩(wěn)定性

取人工尿液樣本,加入線性范圍中高點(diǎn)和低點(diǎn)兩個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平制備3個(gè)平行樣本,分別考察樣品在室溫放置6 h、反復(fù)凍融3次、-80 ℃凍存10 d及經(jīng)處理后室溫放置24 h后的穩(wěn)定性。

結(jié)果表明,在上述考察條件下,目標(biāo)化合物含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%,表明樣品在上述條件下均保持穩(wěn)定。

2.3 尿液測(cè)定結(jié)果

將尿液進(jìn)行處理和分析,得到尿液中目標(biāo)化合物的含量。7名健康志愿者的尿樣連續(xù)測(cè)定10 d,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖 4 7名志愿者尿樣中目標(biāo)化合物的含量(平均值±SD，n=10)

尿液中的Trp主要來(lái)源于食物中外源性的氨基酸和機(jī)體內(nèi)源性蛋白質(zhì)的分解[17],由于志愿者未受運(yùn)動(dòng)和飲食限制,尿樣的色氨酸含量可能會(huì)受到飲食和運(yùn)動(dòng)影響。

經(jīng)測(cè)定,志愿者的尿中Trp的含量波動(dòng)范圍為1.71～25.34 μg/mL,經(jīng)代謝后排泄的Trp是原型量的124%～268%。在Trp的兩條代謝途徑中,經(jīng)Kyn途徑生成Kyn、KA、3-OH-Kyn、3-OH-AA和XA,尿液中的含量分別是0.99～3.72 (3-OH-Kyn)、2.51～21.11 (3-OH-AA)、0.25～1.12 (XA)、0.15～1.53 (Kyn)和0.24～2.58 (KA) μg/mL;經(jīng)5-HT途徑生成的5-HT和5-HIAA,含量分別為0～0.31 μg/mL(5-HT)和2.2～17.94 μg/mL(5-HIAA)。Kyn途徑代謝產(chǎn)物含量是5-HT代謝途徑相關(guān)產(chǎn)物的104%～176%,說(shuō)明Trp經(jīng)Kyn降解生成3-OH-AA和3-OH-Kyn的是Trp的主要代謝產(chǎn)物。尿中的Trp-Kyn代謝產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果與已有報(bào)道[18]結(jié)果一致。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,受試者6(S-6)和受試者7(S-7)間差異較明顯(P<0.05),其余受試者均不存在顯著性差異。

有文獻(xiàn)報(bào)道[19-21]將肌酐作為內(nèi)參,通過(guò)其他化合物濃度與肌酐含量的比值來(lái)進(jìn)行計(jì)算。本方法也以肌酐含量為基準(zhǔn),比較了目標(biāo)化合物含量在不同尿樣中的差異,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體尿樣中目標(biāo)化合物含量有顯著性差異。

3 結(jié)論

本文基于UPLC-MS/MS技術(shù)建立了一種測(cè)定Trp及其代謝產(chǎn)物的定量方法。該方法采用DNS-Cl對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行衍生,方法靈敏度高,重復(fù)性好,可以實(shí)現(xiàn)尿液中目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定量。