高效液相色譜法測定蝦青素油中蝦青素的含量

孔凡華，徐佳佳，郭倩，白沙沙，李東，方從容，邱楠楠*，崔亞娟*

1(國家食品安全風險評估中心，國家衛(wèi)生健康委員會食品安全風險評估重點實驗室，北京，100021) 2(北京市營養(yǎng)源研究所，北京，100069)

蝦青素為萜烯類不飽和化合物，化學名稱是3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素，是一種具有超級抗氧化活性的類胡蘿卜素[1]，其抗氧化性能是維生素E、維生素C、β-胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃質(zhì)的幾十倍甚至幾百倍[2-4]。雨生紅球藻、紅法夫酵母、南極磷蝦、一些浮游生物、藻類、螃蟹外殼、河螯蝦外殼、牡蠣、三文魚皮、鮭魚等動物中含有蝦青素。蝦青素具有多種生物功能，它能終止生物系統(tǒng)中炎癥的發(fā)生[5]、對抗自由基損傷以維持免疫系統(tǒng)防御[6]、降低心臟病發(fā)病的風險[7]、減輕神經(jīng)退行性疾病帶來的影響[8]、抑制腫瘤發(fā)生和生長[9]及對抗紫外線引起的光氧化損傷[10]等。

蝦青素具有較長的共軛雙鍵鏈，結構復雜，化學性質(zhì)不穩(wěn)定，存在多種同分異構體，蝦青素及其異構體的定性定量分析是結構解析和功能研究的基礎。天然蝦青素大多與脂肪酸結合，以酯化的形態(tài)存在，但由于缺乏蝦青素酯標準品，且人工合成蝦青素酯困難，限制了蝦青素酯的定性定量研究。蝦青素酯脫去脂肪酸鏈后可以形成游離的蝦青素，包括全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素等，使蝦青素的定量研究變得容易操作[11]。目前，蝦青素脫脂的主要方法是堿性皂化和酶解方法，堿性皂化脫脂會產(chǎn)生副產(chǎn)物并引起蝦青素降解[12]，食品化學法典(FCC)(2012)[13]采用來自假單胞桿菌的膽固醇酯酶(EC 3.1.1.13)進行蝦青素酯的酶解，可以使蝦青素酯水解完全。色譜技術的發(fā)展在蝦青素的定性定量分析上起了非常重要的作用，隨著紫外可見光譜、質(zhì)譜、核磁共振波譜法、紅外光譜、拉曼光譜和圓二色光譜的快速發(fā)展，蝦青素的結構鑒定變得更為簡單容易，考慮到設備的成本，樣品制備的復雜程度和方法的局限性，蝦青素的定量分析方法主要是分光光度法和高效液相色譜法。分光光度法具有快速簡單、適用范圍廣、成本低等優(yōu)點，但是只能對蝦青素總量進行估算，無法對其中蝦青素的存在形式進行準確的測定。高效液相色譜法分離效果好、靈敏度高、選擇性好成為目前測定蝦青素的常用方法。我國測定蝦青素的標準方法有《紅球藻中蝦青素的測定 液相色譜法》(GB/T 31520—2015)[14]適用于雨生紅球藻藻粉中蝦青素含量的測定；《水產(chǎn)品及其制品中蝦青素含量的測定 高效液相色譜法》(SC/T 3053—2019)[15]適用于魚類、甲殼類及蝦粉、磷蝦油等制品中蝦青索含量的測定；《進出口動物源性食品中角黃素、蝦青素的檢測方法》(SN/T 2327—2009)[16]適用于黃魚、鰻魚、雞肉、雞蛋、鴨肝、豬腎和牛奶中角黃素、蝦青素的測定與確證；《植物提取物 蝦青素油》(T/CCCMHPIE 1.23—2016)[17]適用于以人工培養(yǎng)的紅球藻屬雨生紅球藻為原料經(jīng)提取精制后，得到的蝦青素油中蝦青素的測定。以上標準方法通過有機溶劑直接提取或者堿性皂化脫脂后提取蝦青素，容易引起蝦青素的降解[12]，導致測量結果不準確或?qū)y定結果造成干擾；標準方法多采用三相洗脫系統(tǒng)分離蝦青素及其異構體，對液相系統(tǒng)要求高。本文參照蝦青素檢測的標準方法[14-17]和文獻方法[13，18-23]，設計單因素實驗，對提取試劑、膽固醇酯酶酶解時間進行優(yōu)化，以蝦青素含量的高低作為評價指標，篩選最佳提取試劑和酶解條件；通過比較色譜柱、流動相等高效液相色譜條件，以全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的分離度和峰形對稱性作為評價指標，篩選最佳色譜條件，實現(xiàn)蝦青素油中蝦青素的有效提取和高效分離。以蝦青素油為研究對象，進行方法學驗證，考察方法的科學性、準確性和適用性，并比較實驗建立的酶解方法與文獻中的堿性皂化方法[18]對蝦青素油中蝦青素的提取效率，以期建立蝦青素油中蝦青素的精準分析檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超臨界二氧化碳萃取的雨生紅球藻蝦青素油，市購；全反式蝦青素對照品(純度96.9%)，Dr.Ehrenstorfer GmbH；9-順-蝦青素、13-順-蝦青素對照品(純度≥95.0%)，Sigma公司；膽固醇酯酶16.3 U/mg，月旭科技股份有限公司。

甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、乙酸乙酯(均為色譜純)，美國Fisher公司；無水乙醇、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸(分析純),北京化工廠；石油醚(分析純),福晨(天津)化學試劑有限公司；丙酮(分析純),國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(分析純),浙江聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BS224S分析天平,德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；METTLER TOLEDO pH計，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；QL-901斡旋振蕩器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ZHWY-110X30往復式恒溫水浴搖床,上海智誠分析儀器制造有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超市儀器有限公司；HITACHI CF16RXII 高速冷凍離心機,日本日立科技有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器和ChemStation for LC systems色譜工作站,美國Agilent公司；YMCTMC30色譜柱，5 μm，250 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

(1)0.021 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液：稱取0.084 g氫氧化鈉，加入80 mL 甲醇溶解并定容到100 mL。

(2)0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7)：準確稱取3.028 5 g Tris，加入450 mL去離子水溶解后，用0.5 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，然后用去離子水定容至500 mL。

(3)膽固醇酯酶溶液：稱取6.2 mg膽固醇酯酶于25 mL容量瓶中，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液定容至刻度，膽固醇酯酶溶液濃度約為4 U/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(4)全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素標準儲備液：分別準確稱取全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素標準品1 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，加丙酮溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為40 μg/mL 標準儲備液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(5)全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素混合標準工作溶液：準確移取全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素標準儲備溶液，用丙酮稀釋成各濃度均為0.80 μg/mL的標準工作溶液，用于定性，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(6)全反式蝦青素標準工作溶液：準確移取全反式蝦青素標準儲備溶液，用丙酮稀釋成濃度分別為0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、4.00 μg/mL的標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 色譜條件的選擇

孫偉紅等[19]研究表明，C30色譜柱對蝦青素異構體的分離效果和響應值優(yōu)于C18色譜柱，更有利于定量結果的分析，所以本實驗選擇YMCTMC30色譜柱。參考標準方法和文獻方法，選擇甲基叔丁基醚-乙腈(體積比95∶5)[20]、甲醇-甲基叔丁基醚-水(體積比83∶15∶2)[21]、水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(體積比4.5∶28∶22∶45.5)[22]、水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(5∶85∶5∶5)[23]和甲醇-甲基叔丁基醚[24]等流動相體系洗脫，以全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的分離度作為評價指標，優(yōu)化全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素分離的色譜條件。

1.3.3 提取溶劑的選擇

蝦青素油用丙酮稀釋500倍作為實驗用蝦青素油樣品。實驗參照食品化學法典FCCth(2012)[23]的方法，并加以改進。稱取10 mg蝦青素油樣品于15 mL離心管中，樣品稱取15份，分別加入2 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH=7)和1 mL膽固醇酯酶(4 U/mL)溶液振蕩均勻后，在37 ℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)振蕩酶解60 min，取出立即冷卻至室溫。向每份酶解液中分別加入 2.0 mL石油醚、二氯甲烷-甲醇(體積比1∶3)、丙酮、乙腈、甲醇-乙酸乙酯-石油醚(體積比1∶1∶1)，每種提取溶劑做3個平行，每份樣品均加入1 g無水硫酸鈉后在渦旋振蕩器上渦旋提取2 min，靜置分層后，分別將上層溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，重復提取2次，合并提取液于容量瓶中，氮氣吹干后，用甲醇定容至刻度，溶液過0.45 μm有機系濾膜后，待測定。

1.3.4 酶解時間的選擇

稱取10 mg蝦青素油樣品于15 mL離心管中，分別加入2 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH=7)和1.0 mL膽固醇酯酶(4 U/mL)溶液振蕩均勻后，在37 ℃ 恒溫水浴振蕩器內(nèi)分別振蕩酶解15、30、45、60、75、90、120 min，取出立即冷卻至室溫，用石油醚提取，其他操作步驟同1.3.3。

1.3.5 方法驗證

按照GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[25]方法學要求，建立校準曲線及校準曲線的工作范圍；逐步稀釋樣品上機測定，R(S/N)=3時的測定濃度作為檢出限，R(S/N)=10時的測定濃度作為定量限；稱取蝦青素油樣品，按照實驗優(yōu)化的方法，平行測定6次，計算蝦青素的含量，并計算相對標準偏差，考察方法的重現(xiàn)性；根據(jù)蝦青素油樣品中蝦青素的含量，按本底值的0.5倍、1倍、1.5倍3個濃度水平，進行3水平6平行加標回收實驗，以回收率的高低評價方法的準確度。

1.3.6 堿性皂化脫脂方法

參見YUAN等[18]和蘇芳[26]的方法，稱取10 mg蝦青素油樣品于15 mL離心管中，加入5 mL 0.021 mol/L 氫氧化鈉-甲醇溶液，5 ℃水浴中避光皂化60 min，加入 2 mL 純凈水和 2 mL 石油醚，在渦旋振蕩器上振蕩2 min，靜置分層后，將上層溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，重復提取2次至石油醚層無色，合并提取液于容量瓶中，氮氣吹干后，用甲醇定容至刻度，溶液過0.45 μm有機系濾膜后，測定。

1.4 蝦青素含量的計算

1.4.1 標準曲線的制作

將各濃度全反式蝦青素標準品工作溶液，9-順式蝦青素和13-順式蝦青素標準品工作溶液按實驗優(yōu)化的色譜條件進行液相色譜分析，根據(jù)蝦青素異構體組分的保留時間定性。選定峰面積相近的全反式蝦青素的標準工作液多點校準定量，試樣測定結果以3種蝦青素同分異構體的總和計，外標法定量，同時，標準工作液和樣液的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。

1.4.2 結果計算

試樣中蝦青素的含量X以質(zhì)量分數(shù)計，按式(1)計算。

(1)

式中：X,試樣中蝦青素的含量，%；1.3,13順-蝦青素對全反式蝦青素的校正因子；A13-cis,試樣溶液中13-順-蝦青素的峰面積；Atras,試樣溶液中全反式蝦青素的峰面積；1.1,9-順-蝦青素對全反式蝦青素的校正因子；A9-cis,試樣溶液中9-順-蝦青素的峰面積；Cs,標準工作液中全反式蝦青素的含量，μg/mL；V,試樣溶液體積，mL；As,標準工作液中全反式蝦青素的峰面積；m,試樣質(zhì)量，mg；f,稀釋倍數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的 ChemStation for LC systems工作站軟件完成數(shù)據(jù)的采集與處理。

數(shù)據(jù)的差異性分析在SPSS軟件上進行，P<0.05時，說明差異水平顯著。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

不同流動相體系對全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素分離效果見表1。

目前，多采用三相洗脫系統(tǒng)[14-15,17,19,27]或者正相洗脫系統(tǒng)[26]分離蝦青素及其異構體，對液相系統(tǒng)要求較高，且普適性較差。本實驗通過優(yōu)化液相色譜條件，采用甲醇-甲基叔丁基醚兩相梯度洗脫，可以實現(xiàn)3種蝦青素異構體的有效分離，結果如圖1所示，優(yōu)化得到分離蝦青素的色譜條件為：

色譜柱：YMCTMC30色譜柱，5 μm，250 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)或相當者；柱溫：30 ℃；流動相：見表1；流速：1.0 mL/min；檢測波長：472 nm；進樣量：20 μL。

表1 色譜條件的優(yōu)化Table 1 Optimization of chromatographic conditions

圖1 全反式蝦青素、9-順式蝦青素、13-順式蝦青素標準溶液液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin,13-cis-astaxanthin

2.2 提取溶劑的選擇

室溫條件下，蝦青素在丙酮、二氯甲烷、二甲亞砜、乙醇及其他非極性溶劑中的溶解性較好[28]。本試驗根據(jù)前人研究基礎，選取5種不同提取溶劑，比較不同提取溶劑對蝦青素油中蝦青素的提取得率，結果顯示，石油醚對蝦青素的提取效果最佳，顯著高于其他提取溶劑(P<0.05)，結果見表2，蝦青素油中蝦青素異構體的HPLC色譜圖見圖2。

表2 不同提取溶劑的提取結果(n=3)Table 2 Results of different extraction solvents(n=3)

圖2 蝦青素油脂中全反式蝦青素、9-順式蝦青素、13-順式蝦青素液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin,13-cis-astaxanthin in astaxanthin oil

2.3 酶解時間的選擇

膽固醇酯酶的酶解時間影響蝦青素酯的酶解效果，酶解時間不足，會導致酶解不完全，酶解時間過長，會造成蝦青素的降解，不同酶解時間提取結果見表3。

表3 不同酶解時間的提取結果(n=3)Table 1 Results of different enzymolysis time(n=3)

由表3知，在37 ℃條件下，隨著酶解時間的延長，蝦青素的含量增加， 60 min時酶解完全，蝦青素含量為92.9%，繼續(xù)酶解到75 min和90 min，蝦青素含量分別為90.6%和91.0%，與60 min時沒有顯著性差異(P>0.05)，酶解120 min，蝦青素含量明顯降低(P<0.05)，其原因可能是溫度對蝦青素的降解破壞作用導致，因此酶解時間需要嚴格控制，以避免蝦青素的損失，以4 U/mL 膽固醇酯酶37 ℃條件下酶解60 min最佳。

2.4 方法驗證

2.4.1 線性關系、檢出限及定量限

按照1.3.3操作，在2.1色譜條件下進行HPLC分析，得到全反式蝦青素為0.10～4.00 μg/mL，濃度與峰面積有良好的線性關系，蝦青素的檢出限為0.1 mg/g，定量限為0.3 mg/g。

2.4.2 方法精密度實驗

按實驗優(yōu)化的前處理方法和色譜條件，平行測定6次，蝦青素油中蝦青素含量的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為1.36%，表明精密度高，適合蝦青素的定量分析，結果見表4。

表4 方法精密度結果(n=6)Table 4 Results of precision(n=6)

2.4.3 方法準確度實驗

準確度為分析方法測定的平均值與真值相符的程度。穩(wěn)定樣品中加入不同水平已知量的標準物質(zhì)(將標準物質(zhì)的量作為真值)稱加標樣品；同時測定蝦青素油和蝦青素油加標樣品；加標樣品扣除樣品值后與標準物質(zhì)的誤差即為該方法的準確度，按公式(2)計算。

(2)

式中：P,加入的標準物質(zhì)的回收率；m,加入的標準物質(zhì)的質(zhì)量，μg；X1,加標試樣的測定值，μg；X0,未加標試樣的測定值，μg。采用樣品加標試驗進行本方法準確度驗證，結果見表5。

表5 加標回收率實驗結果(n=6)Table 5 Results of recovery rate of ginger(n=6)

由表5可知，蝦青素油中蝦青素的回收率為90.39%～98.48%，平均回收率為93.58%，RSD為2.84%，表明方法添加回收率高，相對標準偏差小，適合蝦青素含量的測定。

2.5 不同脫脂方法測得蝦青素的含量

比較實驗建立的膽固醇酯酶酶解方法、堿性皂化方法對蝦青素油中蝦青素的提取效率，結果見表6。

表6 不同脫脂方法測定結果(n=3)Table 6 Results of different degreasing methods(n=3)

由表6可知，膽固醇酯酶酶解所得蝦青素含量是92.9%，顯著高于苗鳳萍[29]報道的72.04%和ZHAO等[12]報道的63.2%，與蘇芳[26]報道的92.95%結果相近。酶解所得蝦青素含量是堿性皂化得率的2.11倍，這可能是因為堿不僅對脂肪酸有破壞作用，對蝦青素也有很大的降解作用，而膽固醇酯酶對脂肪酸有特異性，可以減少對蝦青素的降解。張麗瑤等[30]研究表明蝦青素溶液經(jīng)超聲處理后，全反式異構體的濃度大幅度降低，9-順式和13-順式異構體濃度均有所增加，超聲處理使蝦青素降解為其他成分。對比蝦青素的得率，可見，酶解法對蝦青素的含量影響較小，先酶解再進行高效液相色譜分析是對含蝦青素酯樣品的含量及幾何異構體測定的可靠方法，可以準確定量樣品中蝦青素的含量。

3 結論

本實驗在前人研究的基礎上，設計單因素實驗，對提取試劑、膽固醇酯酶酶解時間進行優(yōu)化，以蝦青素得率高低作為評價指標，得到蝦青素油中蝦青素的最佳提取條件為37 ℃恒溫水浴振蕩酶解60 min，石油醚提取，該方法對蝦青素油中蝦青素的提取得率為92.9%，是堿性皂化得率的2.11倍。通過比較色譜柱、流動相等高效液相色譜條件，以全反式蝦青素、9-順-蝦青素、13-順-蝦青素的分離度和峰形對稱性作為評價指標，篩選最佳色譜條件為YMCTMC30色譜柱，甲醇-甲基叔丁基醚兩相梯度洗脫，可以實現(xiàn)3種蝦青素異構體的有效分離，相比于目前常用的三相洗脫程序和正相洗脫系統(tǒng)，要求的液相系統(tǒng)簡單。選擇蝦青素油進行方法學驗證，結果表明，全反式蝦青素在0.10～4.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系；蝦青素的檢出限為0.1 mg/g，定量限為0.3 mg/g；按實驗優(yōu)化的最佳酶解方式和色譜條件，平行測定6次，蝦青素油中蝦青素含量的RSD為1.36%，表明精密度高；按蝦青素油樣品中蝦青素含量的0.5倍、1倍、1.5倍3個濃度水平，進行3水平6平 行加標回收實驗，得到蝦青素油中蝦青素的回收率為90.39%～98.48%，平均回收率為93.58%，RSD為2.84%，表明添加回收率高，相對標準偏差小，實驗建立的方法適合蝦青素油樣品中蝦青素含量的測定。