羊乳制品中摻雜牛乳鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

李婧妍，安樂，韓波，張瑞雪，張靜雅，2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

0 引 言

羊乳富含多種維生素、礦物元素、短鏈脂肪酸以及大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白結(jié)構(gòu)成分與母乳基本相同，被營養(yǎng)學(xué)界稱為“奶中之王”。其乳脂肪球微粒小、乳糖含量低，易于被人體吸收，長期飲用不會(huì)導(dǎo)致肥胖。羊乳還含較少的致敏性αs1-酪蛋白（αs1-CN）和乳球蛋白（β-Lg），可作為牛乳不耐受人群或胃腸較弱和體質(zhì)較差嬰兒的良好乳源[1]。但羊乳及其制品的成本比牛乳高很多，兩者價(jià)格相差大概一倍。在利益驅(qū)動(dòng)下，羊乳、羊酸奶、羊奶粉和羊奶酪等制品中摻雜牛乳現(xiàn)象非常普遍，這對(duì)一些牛乳過敏者可能造成傷害，也嚴(yán)重影響羊乳市場健康發(fā)展。要杜絕這種乳源摻假現(xiàn)象，關(guān)鍵問題之一是要建立快速準(zhǔn)確的鑒別手段。目前，鑒定羊乳及其制品中是否摻雜牛乳的檢測方法主要依據(jù)兩者蛋白質(zhì)、DNA分子和脂肪酸組成等特征指標(biāo)構(gòu)建，所涉及的檢測技術(shù)包括電子鼻法[2]、光譜法[3]、酶聯(lián)免疫法（EILSA）[2-8]、PCR法[9-26]、電泳法[27-33]、色譜及色譜-質(zhì)譜法[34-37]和蛋白質(zhì)組學(xué)法等[38-42]。其中ELISA法、PCR法、電泳檢測法、色譜及色譜-質(zhì)譜法和蛋白質(zhì)組學(xué)法是近年來鑒偽能力最為精確、檢測手段最先進(jìn)的方法，本文綜述了這5種鑒別方法的特征和適用性，旨在為后續(xù)研究提供參考。

1 ELISA檢測技術(shù)

ELISA方法是基于牛源蛋白抗原特異性實(shí)現(xiàn)的，因此牛源性抗原的選擇是方法建立的關(guān)鍵。乳蛋白以酪蛋白和乳清蛋白為主，其中乳清蛋白由β-乳球蛋白（β-Lg）、α-乳白蛋白(α-La)、血清白蛋白（BLA）、免疫球蛋白（IgG）和乳鐵蛋白等組成；酪蛋白（CN）由αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN組成?？乖倪x擇一般要求在牛乳中豐度高且穩(wěn)定，一般選擇αs1-CN、β-CN、IgG等單一蛋白分子，且需具有較高的種屬特異性決定簇，即牛源性抗原產(chǎn)生的抗體不會(huì)與其他種屬抗原結(jié)合，只專一性結(jié)合牛乳中的蛋白。

抗體的制備是建立ELISA的另一個(gè)關(guān)鍵，包括多克隆抗體和單克隆抗體兩類。通常認(rèn)為羊抗牛適合檢測羊乳中的牛乳成分，因?yàn)檠虻拿庖呦到y(tǒng)對(duì)自身抗原免疫耐受，因此羊抗?？贵w不會(huì)交叉結(jié)合羊乳蛋白。Anguita[4]和Hurley[5]等分別用牛β-CN和IgG制備牛源性單克隆抗體并建立間接ELISA反應(yīng)體系，專一性結(jié)合牛源蛋白，其最低可檢出0.5%的摻假率。薛海燕[6]和Song[7]等將制備的牛β-CN多克隆抗體與羊β-CN進(jìn)行免疫吸收封閉，以提高抗體特異性，制備的多克隆抗體均可特異性識(shí)別牛β-CN的某些特異性表位，且對(duì)牛α-CN、κ-CN和乳清蛋白無交叉活性，摻假牛乳的最低檢出量在2%～4%之間，且熱處理對(duì)制備的抗體也無顯著影響，表明該方法在滅菌乳的檢測中同樣適用。在多克隆抗體研究中，張世偉[8]等以牛IgG和其Fc片段為抗原，制備抗牛IgG的多克隆，并將以此蛋白作為包被抗體構(gòu)建雙抗夾心ELISA方法。該方法無需復(fù)雜的前處理即可準(zhǔn)確檢測牛乳含量，方法靈敏度可達(dá)到0.1μg/mL。ELISA技術(shù)具有高靈敏、高特異性、快速等優(yōu)點(diǎn)，不需昂貴儀器設(shè)備，特別適合對(duì)大量樣品的篩檢，如果ELISA試劑盒的研發(fā)成功，可推廣到小型乳品企業(yè)和基層實(shí)驗(yàn)室，提高檢測效率，降低操作人員工作難度。但ELISA分析也存在之一些缺陷，例如對(duì)試劑的選擇性高，且對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)等。

2 PCR檢測技術(shù)

ELISA檢測在生鮮乳中應(yīng)用效果較好，但市售的乳制品大多經(jīng)過高溫高壓處理，并添加多種食品添加劑，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性發(fā)生改變，特有蛋白或抗原決定部位也發(fā)生相應(yīng)改變。而以動(dòng)物種屬間遺傳信息差異作為物種鑒別靶標(biāo)的PCR檢測法具有良好的耐高溫性，不僅可以檢測原料乳，也可檢測加工處理后的的高溫滅菌乳、酸乳和乳酪等制品。泌乳過程中脫落到乳中的體細(xì)胞（1×104～1×107/mL）內(nèi)含有遺傳物質(zhì)DNA，可提供乳源的有效信息。羊乳制品引入牛源成分的同時(shí)也引入該種屬特異性遺傳物質(zhì)，因此可通過樣品中是否存在牛源PCR產(chǎn)物進(jìn)行摻偽鑒定[9]。Plath等[10]最先將PCR方法用于羊乳和羊乳干酪中牛源成分的鑒定，在對(duì)基因組DNA中β-CN部分序列擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，山羊和綿羊乳β-CN DNA中存在牛乳不存在的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，如果摻雜了牛源成分，在選擇性限制酶分析和PAGE后，牛源性樣品中未被消化水解的β-CN會(huì)出現(xiàn)譜帶，該方法最低可檢出0.5%牛源成分。

利用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)，Abdel-Rahman[11]等人建立了綿羊乳源中水牛乳和普通牛乳的鑒定方法。不同種屬的生物個(gè)體DNA序列存在差別，PCR-RFLP技術(shù)是利用同一種限制性內(nèi)切酶切割下不同物種DNA序列，產(chǎn)生不同長度大小、不同數(shù)量的限制性酶切片。

水牛和普通牛乳擴(kuò)增出603 bp大小的基因片段，羊乳擴(kuò)增出374 bp大小的特異性條帶。該技術(shù)還可對(duì)水牛乳和普通牛乳進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，對(duì)兩種牛乳線粒體細(xì)胞色素b（cyt-b）擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，發(fā)現(xiàn)水牛乳經(jīng)限制性內(nèi)切酶Taq I酶切PCR產(chǎn)物后，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測出兩條明確酶切條帶（191 bp和168 bp的片段），而普通奶牛乳沒有被酶切，條帶仍然為603 bp。因此，可根據(jù)是否存在這兩條酶切條帶準(zhǔn)確進(jìn)行種屬鑒定，最低可檢出綿羊和山羊干酪中摻入0.5%牛源成分。Lanzilao等[12]同樣用PCR-RFLP和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合對(duì)cyt-b基因進(jìn)行擴(kuò)增，可鑒定混合乳中奶牛、水牛、山羊和綿羊乳成分。

在目的基因選擇方面，很多研究認(rèn)為線粒體DNA（mt DNA）比核基因組DNA更適合物種鑒定。因?yàn)閙t DNA基因組結(jié)構(gòu)在物種間高度保守，一級(jí)結(jié)構(gòu)有很大差異，并且在細(xì)胞中的復(fù)制數(shù)量較多，可得到有效擴(kuò)增，更適合于物種的鑒定研究。另外，線粒體特異序列區(qū)（D-環(huán)區(qū)、cyt-b）和保守序列區(qū)（12SrRNA，16SrRNA）也常用來作為目的基因。Maudet[13]、De[14]、Bania[15]和López-Calleja[16]等分別設(shè)計(jì)牛種屬特異性探針對(duì)線粒體D-環(huán)區(qū)、cyt-b和12S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠-EB染色后，其牛乳檢出限均可達(dá)到0.1%以上。

多重PCR檢測技術(shù)也是檢測食品摻假的有效手段，該技術(shù)在同一PCR體系中加入不同種屬特異性基因的特異性引物，可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)模板的不同區(qū)域，得到相應(yīng)的而不同長度的PCR產(chǎn)物，以此來檢測目標(biāo)物是否存在。Kotowicz[17]、Botter[18]和López-Calleja[19]等在同一PCR管中均實(shí)現(xiàn)了對(duì)普通牛乳、山羊乳和綿羊乳線粒體保守序列區(qū)（12S rRNA和16S rRNA）特異性片段的同時(shí)擴(kuò)增，建立了3種乳源的多重PCR快速檢測方法。在靈敏度方面，多重PCR與單重PCR具有相同的檢測靈敏度。

經(jīng)過高溫處理的乳制品，其DNA降解為許多僅有幾百個(gè)堿基的小片段，如果檢測目的片段太大，可能無法發(fā)現(xiàn)陽性片段，而受電泳檢測有效性的限制，傳統(tǒng)PCR難以采納小片段目的產(chǎn)物。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)現(xiàn)整個(gè)PCR過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析，對(duì)小片段目標(biāo)產(chǎn)物可以準(zhǔn)確定量。RT-PCR法不但具有常規(guī)PCR敏感度高、污染概率小等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也可通過一次擴(kuò)增同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)基因。另外，實(shí)時(shí)定量PCR不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，可快速、高通量擴(kuò)增，在檢測動(dòng)物源性成分中得到廣泛的應(yīng)用。目前，熒光標(biāo)記的方法有兩種，非特異性熒光標(biāo)記（SYBR Green I法）和特異性熒光標(biāo)記（Tapman探針法）。

SYBR Green I是一種與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，產(chǎn)生的熒光信號(hào)和雙鏈DNA分子數(shù)成正比，具有快速、靈敏、低成本和高通量等優(yōu)點(diǎn)。Liao等[20]設(shè)計(jì)牛特異性探針12SBT-REV，對(duì)線粒體12SrRNA序列中346 bp進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用瓊脂糖電泳和熒光SYBR Green RT-PCR進(jìn)行鑒定。Agrimonti等[21]基于該染色法，使用四重實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)建立了可同時(shí)鑒定鮮乳和干酪中奶牛、山羊、綿陽、水牛4種乳源的快速定性方法，并可對(duì)其中奶牛DNA進(jìn)行定量，定量限為0.1%。

Taqman法是用特異性熒光探針識(shí)別和檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，所得數(shù)據(jù)更為精確。該研究大多參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高度保守的16S rRNA、12S rRNA、cyt-b的種內(nèi)保守中間特異性區(qū)域作為牛羊特異檢測的靶序列，設(shè)計(jì)樣品通用引物序列和特異分子信標(biāo)探針后（常用的探針有FAM、HEX熒光探針、淬滅基團(tuán)為TAMRA），通過優(yōu)化反應(yīng)體系中的引物濃度、探針濃度和退火溫度等條件，建立能同時(shí)檢測羊牛乳成分的熒光定量PCR體系[22-25]。這類方法對(duì)純DNA含量的最低檢出濃度為0.01 ng，對(duì)羊奶中摻入牛奶和豆?jié){的體積摻假檢測靈敏度均為0.1%。也有研究不提取DNA[26]，經(jīng)核酸釋放劑處理后，直接進(jìn)行熒光定量PCR檢測鑒定羊奶粉中的牛源性成分。

PCR檢測技術(shù)是羊奶摻假研究最多的檢測方法，具有通量大、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)PCR法需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳才能完成整個(gè)檢測，一旦遇到可疑陽性結(jié)果，必須進(jìn)行酶切鑒定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不需后處理，克服了普通PCR假陽性問題和交叉污染，也不受摻假形式的影響，可自動(dòng)實(shí)時(shí)檢測分析，已在動(dòng)物源性成分檢測項(xiàng)目上取代一般PCR方法成為最為常用的分子生物學(xué)檢測的手段。熒光PCR技術(shù)在乳源檢測的運(yùn)用過程中也受到一些限制，主要是因?yàn)楦鞣N乳品經(jīng)過不同程度的深度加工，其中所含有的DNA成分遭到不同程度的破壞，并且在生產(chǎn)過程中混入不同的添加劑和佐料，使食品的成分更加復(fù)雜。

3 電泳檢測技術(shù)

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）具有分子篩效應(yīng)，能夠有效分離乳中主要蛋白質(zhì)，可依據(jù)不同乳源蛋白分子量差異同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析。Pesic[27]以全乳和乳清蛋白為樣品，以牛源β-Lg、α-La為目標(biāo)物，利用未變性-PAGE技術(shù)比較混合牛羊乳中電泳條帶強(qiáng)度，對(duì)牛乳含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示牛乳在山羊奶中檢出限為3%，在綿羊奶中為5%。阿力木等[26]以不同乳源的乳清蛋白為樣品，利用SDS-PAGE電泳技術(shù)分離乳清蛋白，確定羊乳與牛乳差異性蛋白為乳鐵蛋白，并通過灰度分析定量摻偽比率。然而，PAGE具有一定的局限性，耗時(shí)長、勞動(dòng)強(qiáng)度大，且對(duì)小分子物質(zhì)的檢測能力弱。

毛細(xì)管電泳（CE）是基于被分離物質(zhì)的荷質(zhì)比差異，在電場力作用下，可根據(jù)目標(biāo)物在緩沖溶液中的遷移速度不同實(shí)現(xiàn)分離。對(duì)于結(jié)構(gòu)相似但電荷不同的多肽蛋白，通過調(diào)節(jié)pH值、改變?nèi)苜|(zhì)電荷和淌度達(dá)到分離目的。CE技術(shù)能夠快速、可靠地分離乳中酪蛋白和乳清蛋白，且僅使用少量樣品和緩沖液即可獲得高分辨率和良好的定量結(jié)果，已成功應(yīng)用綿羊和山羊乳中摻雜牛乳的鑒定[29]。Trimboli[30]、劉鳴暢[31]、Muller[32]等建立了不同的緩沖體系，通過CE蛋白遷移圖譜選擇目標(biāo)蛋白進(jìn)行摻假定量分析。Cartoni和Trimboli等在pH 9.0-10.0的硼酸鈉緩沖環(huán)境中分別分離出牛β-Lg A和αs-CN為特征目標(biāo)物；劉鳴暢等建立了2%SDS緩沖液體系，發(fā)現(xiàn)牛乳中β-CN可作為牛乳目標(biāo)物，可鑒定嬰幼兒配方羊乳粉、乳清粉中0.5%的牛乳摻雜量。Muller等在高離子強(qiáng)度的酸性環(huán)境（pH 1.9），以非牛β-Lg在牛羊混合乳中的比例為基礎(chǔ)，結(jié)合質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了測定牛乳摻假量的方法。

等電聚焦電泳法（IEF）也可用于乳制品摻假，其原理是通過兩性電解質(zhì)建立一個(gè)pH梯度環(huán)境，電泳時(shí)蛋白質(zhì)遷移到其相應(yīng)的等電點(diǎn)的pH處形成區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物分離。[33]等用IEF法檢測羊乳干酪中牛乳摻假，對(duì)酪蛋白進(jìn)行分離后，對(duì)β-Lg水解產(chǎn)物γ-CN進(jìn)行等電聚焦，可定量檢測牛乳中γ-CN含量，檢出限為1%。該方法在新鮮干酪和熱加工再制干酪中均具有較高的鑒偽能力。與其他檢測技術(shù)相比，電泳法具有分離模式多、分析時(shí)間短、分辨率高，樣品和試劑消耗極少等優(yōu)點(diǎn)。但電泳分析法操作繁瑣費(fèi)時(shí)，需對(duì)電泳條帶分析以表明各種蛋白質(zhì)的相對(duì)分布，對(duì)目標(biāo)蛋白的定量難以精確，且制備能力差。但如果能在電泳技術(shù)基礎(chǔ)上研發(fā)檢測試紙，則可作為初步鑒定摻偽乳源的手段。

4 色譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在摻假鑒定中主要通過對(duì)乳蛋白進(jìn)行定性識(shí)別。單獨(dú)使用色譜技術(shù)分析時(shí)，目標(biāo)物為牛羊乳中不同的酪蛋白，主要依據(jù)α-CN、β-CN和κ-CN在反相HPLC中和固定相結(jié)合能力不同進(jìn)行分析。Veloso[34]等利用HPLC定量分析生牛乳、綿羊乳和山羊乳中α-CN、β-CN、κ-CN含量，指出牛羊乳中α-CN含量存在顯著差異，該方法可對(duì)摻雜了5%牛乳的羊乳進(jìn)行定量。作者還對(duì)該方法在干酪成熟30 d過程中的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果穩(wěn)定可靠。Natercia等[35]用疏水色譜法（HIC）對(duì)生牛乳、山羊乳和綿羊乳及其乳酪制品中αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN進(jìn)行分離，通過對(duì)αs1/κ-CN、αs2/β-CN、β/κ-CN和αs1/αs2-CN峰面積比值對(duì)摻雜比率進(jìn)行分析，其檢出能力最低為2%。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中，首先依托HPLC對(duì)乳蛋白進(jìn)行分離，再利用蛋白圖譜特征指標(biāo)變化結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行之間質(zhì)譜（MALDI-ToF）或電離質(zhì)譜（MALDI-MS）等技術(shù)聯(lián)用實(shí)現(xiàn)。質(zhì)譜技術(shù)所需樣品量小，能夠檢測到相當(dāng)高的肽段數(shù)量和氨基酸序列，在蛋白質(zhì)識(shí)別和定量方面具有較高的可信度和靈敏度。Nicolaou等[36]利用MALDI-ToF-MS技術(shù)對(duì)牛乳、山羊乳和綿羊乳分別進(jìn)行蛋白圖譜掃描，用偏最小二乘法和非線性核最小二乘法對(duì)牛乳摻入羊乳比例與蛋白譜圖中特征指標(biāo)變化趨勢的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)羊乳中摻雜牛乳比率與這些特征指標(biāo)的變化呈正相關(guān)。在判定山羊乳中牛乳含量時(shí)，以蛋白譜圖中β-Lg與α-La比值作為特征指標(biāo)；判定綿羊乳中牛乳含量時(shí)，以綿羊乳中特有的γ2和γ3酪蛋白為特征指標(biāo)，該方法最小可檢測5%摻雜比率。對(duì)于質(zhì)譜法經(jīng)常出現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)問題，Ke等[37]用同位素內(nèi)標(biāo)法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償，以4種酪蛋白（αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN）和兩種乳清蛋白（β-Lg、α-La）為目標(biāo)物，用HPLC-MRM技術(shù)篩選其水解特征肽段作為摻假標(biāo)志物，對(duì)特征肽進(jìn)行了定性和定量分析，該方法在山羊乳和綿羊乳乳清蛋白粉和嬰幼兒配方奶粉中摻假牛乳目標(biāo)蛋白檢出限0.01～0.05 g/100g，回收率82.3%～116.6%。

超臨界流體色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（SFC-Q-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)也成功應(yīng)用于摻偽鑒定中，主要依據(jù)游離脂肪酸酯化到甘油分子骨架的不同位置，通過分析牛羊乳中復(fù)雜的甘油三酯（TAG）組成來判斷乳源類型[38]。乳脂中的三酰甘油成分復(fù)雜，采用標(biāo)準(zhǔn)品定性困難，而通過Q-TOF-MS提供的精確質(zhì)量數(shù)與豐富的碎片信息識(shí)別牛羊乳中TAG組成差異則是一種快速鑒定手段。該方法共鑒定出55種TAG，其中牛乳48種，羊乳53種，并指出其?；溈偺紨?shù)和雙鍵數(shù)量均存在差異。其中羊乳中短鏈TAG和長鏈TAG含量較牛乳多，且不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸含量）較高。應(yīng)用主成分分析法（PCA）處理SFC-MS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩種樣品較好地分布在兩個(gè)區(qū)域，表明其存在較明顯的差異。其中區(qū)分羊奶樣品的重要TAG指標(biāo)為：O-P-O、O-P-C、O-P-L、O-S-O和P-Co-C；區(qū)分牛奶樣品的重要TAG指標(biāo)為：P-P-Co、O-P-Co、O-M-Co、O-Bu-O和O-P-P。

與其他技術(shù)相比，色譜質(zhì)譜法的優(yōu)勢是不可替代的，檢測方法的高通量是摻假快速檢測的最佳選擇，而且色譜和質(zhì)譜法的操作也越來越智能化。且針對(duì)牛乳過敏人群的產(chǎn)品，尤其是嬰幼兒配方羊乳粉產(chǎn)品的檢測中，利用色譜和質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行痕量分析是十分必要的。但色譜質(zhì)譜研究的最大問題在于食品復(fù)雜的基質(zhì)對(duì)儀器的靈敏度有很大影響。另外，色譜和質(zhì)譜類儀器昂貴，前處理操作復(fù)雜，對(duì)分析操作人員要求較高，僅適合用于大型乳品企業(yè)和監(jiān)管部門等進(jìn)行摻偽鑒定。

5 蛋白組學(xué)檢測技術(shù)

蛋白組學(xué)作為后基因時(shí)代的一個(gè)新的研究手段迅速發(fā)展，已成為鑒別各類功能性食品或高附加值食品真?zhèn)蔚挠辛ρ芯抗ぞ?。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被成功應(yīng)用到乳及乳制品摻假研究，主要還是通過對(duì)乳清蛋白（β-Lg、α-La）和4大酪蛋白家族（αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN）進(jìn)行分離鑒定。牛羊乳種屬間差異乳蛋白進(jìn)行組學(xué)研究，不僅可對(duì)乳源蛋白含量及變化進(jìn)行鑒定，也可對(duì)乳蛋白的糖基化、磷酸化等翻譯后修飾的改變進(jìn)行特征性描述。Stepanka等[39]比較了MALDI-TOF-MS和LC-ESI-TOF技術(shù)在乳源摻假中的鑒定能力，并結(jié)合主成分分析法和蛋白數(shù)據(jù)庫對(duì)捷克市場上常見的27種羊乳干酪的真實(shí)性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF法僅能區(qū)別部分摻假樣品，而應(yīng)用LC-ESI-TOF技術(shù)發(fā)現(xiàn)牛α-s-CN的特異性序列可作為標(biāo)記物鑒定羊乳中是否摻雜牛乳。

Camerini[40]等用MALDI-MS和LC-MS/MS技術(shù)聯(lián)合檢測水牛、綿羊和山羊乳清制作的Ricotta干酪中摻雜奶牛乳的含量。將提取的乳清干酪蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，胰蛋白酶水解，獲得的多肽溶液經(jīng)反相HPLC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行定性和定量分析。發(fā)現(xiàn)奶牛乳β-LG的C-末端肽（LSFNPTQLEEQCHI，m/z 858.4）與其他乳源均有差異，且在質(zhì)譜中響應(yīng)值高，可作為奶牛乳清的特異性肽，其最低檢出能力為0.5%。Chen等[41]同樣以β-Lg作為目標(biāo)蛋白，同樣發(fā)現(xiàn)牛（LSFNPTQLEEQCHI，m/z 858.6/462.2）和羊（LAFNPTQLEGQCHV,m/z807.5/600.2）種屬特異性肽可分別作為區(qū)分牛羊乳的指標(biāo)。Bernardi[42]等使用Up-down分離法和HPLC-MS/MS結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出山羊乳、綿羊乳、水牛乳和奶牛乳的種屬特異性肽。用胰蛋白酶直接水解全乳樣品，經(jīng)HPLC-MS/MS鑒定和Mascot軟件分析蛋白水解肽的組成和分子量，發(fā)現(xiàn)αs1-CN gi/311943的一個(gè)肽段（YLGYLEQLLK，m/z 620.3）可作為山羊乳水解肽的標(biāo)記物以區(qū)分綿羊乳和牛乳；另一個(gè)m/z830.9的未知蛋白肽段（MSHLVLSNVGISFTR）可作為牛種屬特異性肽作為判斷摻假的標(biāo)記物。該方法在干酪生產(chǎn)加工和后熟過程中同樣適用。蛋白質(zhì)組學(xué)能為乳源鑒偽提供系統(tǒng)性信息，不僅能夠用于乳源鑒偽，還能用于乳源品質(zhì)認(rèn)證，是鑒偽工作中最為精準(zhǔn)的技術(shù)手段，可作為仲裁和出入境檢測過程中的有效工具。該方法的局限性是檢測成本和對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)要求很高，且儀器設(shè)備的使用和后期維護(hù)產(chǎn)生較大的費(fèi)用。

6 結(jié) 論

本文從檢測的目標(biāo)成分、檢測手段、結(jié)果靈敏度以及檢測效率等方面對(duì)羊乳中摻雜牛乳的檢測方法進(jìn)行了論述。ELISA和電泳技術(shù)有著較高的準(zhǔn)確度，如能依據(jù)其反應(yīng)原理制成檢測試劑盒或試紙，則可用于生產(chǎn)過程批量定性檢測。但試劑盒或試紙的研發(fā)需要投入大量的精力，需要研究人員付出很多的努力。PCR檢測方法以DNA檢測為依據(jù)，靈敏度和特異性均較高，可檢出痕量牛乳含量。但該方法前處理時(shí)間較長，不適用于快速檢測，一旦樣品感染乳腺炎，體細(xì)胞數(shù)量易受到炎癥污染，將無法進(jìn)行鑒定。色譜-質(zhì)譜技術(shù)以及蛋白組學(xué)技術(shù)是當(dāng)今發(fā)展最快、也是最為準(zhǔn)確的檢測手段。這類技術(shù)是以牛羊乳蛋白之間結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異為依據(jù)，并基于這些差異性進(jìn)行分離、區(qū)別和鑒定，可反應(yīng)乳蛋白各種特征的真實(shí)情況，具有其他研究方法不可取代的優(yōu)勢。文中總結(jié)的5種研究方法、技術(shù)手段以及適用性各不相同，旨在為羊乳摻假檢測研究提供更多的思路，使乳源鑒偽研究不局限于單一研究方法和單項(xiàng)檢測結(jié)論，且在鑒定過程中，也很可能需要多種檢測方法相互輔助才能得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。