Puf蛋白的功能及作用機制

王臣榮，劉 晶，劉 群*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀 100193；2.農(nóng)業(yè)部動物流行病學與人畜共患病重點實驗室農(nóng)業(yè)部國家動物寄生原蟲實驗室，北京海淀 100193)

大多數(shù)真核生物都嚴格依賴基因的表達來調控其生命周期。例如，瘧原蟲和弓形蟲通過調控基因的表達以確保其正確的增殖和分化?；虮磉_調控通常在轉錄和轉錄后水平上調控，而基因轉錄后水平的調控比轉錄水平調控更快，所以機體在應對各種環(huán)境變化上，基因轉錄后水平的調控被認為是一種快速有效的策略。

在真核細胞中，基因的表達通常通過mRNA 3端非翻譯區(qū)(3′UTR)來調控。許多mRNA 3′UTR含有與RNA結合蛋白(RBP)結合的調控元件。RBP通過作用于RNA的代謝在轉錄后調控中起著至關重要的作用[1]。RBP通常具有保守的基序或結構域，例如RNA識別基序、五肽重復序列、鋅指、KH結構域、DEAD/DEAH框以及Pumilio/FBF結構域(Puf域)。在真核生物中Puf家族(果蠅Pumilio蛋白和秀麗隱桿線蟲Fem-3結合因子合稱)是一大類保守的RBP家族。Puf主要通過結合mRNA 3′UTR中的特定識別序列來控制其穩(wěn)定性和翻譯，從而控制各種生理過程[2]。

Puf家族至少由3個亞家族組成：①經(jīng)典Puf蛋白，其結構域三維結構類似于一個新月形結構，該新月形結構以序列特異性方式與單鏈RNA結合。Puf蛋白結合3′UTR中含有-UGU-的核心特異性序列進而調節(jié)靶mRNA的表達，并且Puf蛋白的靶mRNA的種類或功能在進化上較為保守；②Puf-A亞家族結構域呈現(xiàn)L形，其通過與磷酸骨架的相互作用與RNA/DNA結合；③Nop9亞家族結構域呈現(xiàn)C形，其通過識別序列和RNA的結構元件來調控基因的表達。經(jīng)典Puf蛋白主要位于細胞質中，而Puf-A和Nop9蛋白主要位于核仁中，并在核糖體生物發(fā)生中起作用[3-4]。但是Puf-A和Nop9蛋白在哺乳動物和原蟲中的功能和機制尚未見研究報道。

各種真核生物中都表達Puf蛋白，但表達Puf蛋白的數(shù)目不同。在秀麗隱桿線蟲和克氏錐蟲中分別發(fā)現(xiàn)了11個和10個Puf蛋白。在惡性瘧原蟲、弓形蟲和人中也分別鑒定出2個Puf蛋白[5-6]。已經(jīng)有報道對Puf蛋白的多種生物學功能方面進行研究，本論文僅對已報道的哺乳動物和原蟲中Puf蛋白的定位、功能及其作用機制進行總結和分析，以期為原蟲新藥或疫苗的開發(fā)提供新思路。

1 不同物種來源Puf蛋白的定位

富含各種基序的3′UTR控制其mRNA的命運。帶有相同基序的不同mRNA可能以相似的方式受到調控[7]。這些mRNA與不同的RNA結合蛋白(RBP)相互作用形成無膜核糖核蛋白(RNP)顆粒。RNP顆?？赡芸刂七@些mRNA的命運，RNP顆粒一般包括應激顆粒和加工體。研究表明形成應激顆粒的弓形蟲表現(xiàn)出更高的體外生存能力，并且應激顆粒的大小和數(shù)量會影響其體外生存能力，因為許多mRNA在應激顆粒中被抑制翻譯，而對寄生蟲存活很重要的mRNA被增強翻譯。加工體中富含mRNA衰減因子和翻譯抑制的mRNA。研究發(fā)現(xiàn)PUM1/2定位于RNP顆粒，在氧化應激誘導的應激顆粒中發(fā)現(xiàn)PUM1和PUM2，并且PUM1/2也在P體中被發(fā)現(xiàn)，同時PUM2的過表達可以誘導應激顆粒的形成[8-9]。弓形蟲擁有2個Puf蛋白，但其細胞內定位尚未研究。Puf蛋白的無序區(qū)域及mRNA的基序對RNP顆粒形成至關重要[10]，但是尚不清楚Puf的顆粒定位及顆粒溶解是否影響其功能。

2 Puf蛋白的功能

2.1 參與生命過程中不同階段的轉換

瘧原蟲編碼3個Puf蛋白(Puf1，Puf2和Puf3)[11]。其中Puf2在配子細胞和子孢子階段起著重要作用，PfPuf2或PbPuf2的敲除促進了有性階段的分化，進而產(chǎn)生更多的雄性配子細胞[12]。PbPuf2的敲除增強了UIS2磷酸酶的表達，進而抑制了瘧原蟲子孢子eIF2α的磷酸化，進而導致瘧原蟲子孢子喪失了感染活性[13]。弓形蟲的緩殖子與瘧原蟲的子孢子特性相似，而弓形蟲Puf蛋白是否在緩殖子形成過程中發(fā)揮作用尚未見報道。

2.2 參與核糖體生成與rRNA加工

Puf蛋白在rRNA加工和核糖體生成中起重要作用。酵母NOP9是一種含有Pum重復序列的蛋白質，其對pre-18S rRNA的加工至關重要。人源Nop9影響18S小亞基核糖體RNA的產(chǎn)生，惡性瘧原蟲PfPuf3也參與核糖體的生成。人源Puf-A會影響90S核糖體前體的裝配。布氏錐蟲PUF7的沉默導致rRNA加工受抑制?？梢姴煌颬uf蛋白在體核糖體生成與rRNA加工過程中的發(fā)揮著重要且保守的作用。

2.3 其他功能

最近研究表明Puf蛋白可以調控靶mRNA的定位。酵母Puf5通過過氧化物酶體影響PEX14 mRNA的定位。Puf還在調節(jié)mRNA穩(wěn)定及DNA修復中發(fā)揮作用，例如布氏錐蟲PUF9穩(wěn)定其靶轉錄本(LIGKA，PNT1，PNT)，當DNA受損時，Pum1蛋白的表達量降低，進而激活DNA修復途徑對DNA進行修復[14]。小鼠肌細胞Pum2和秀麗隱桿線蟲肌細胞Puf8的敲除會影響線粒體的功能[15]。Pum1和Pum2會抑制細胞周期抑制基因Cdkn1b的表達來控制小鼠身體和器官的大小[16]，由此可見，不同物種Puf蛋白除了發(fā)揮其保守功能外，還參與調控其他許多生物學過程。

3 Puf蛋白調控靶mRNA的作用機制

在瘧原蟲和弓形蟲中，基因的翻譯主要發(fā)生在細胞質、線粒體和頂質體。瘧原蟲大部分基因在細胞質中翻譯，大約50個基因在頂質體中被翻譯，只有3個基因在線粒體中被翻譯。由于經(jīng)典Puf蛋白的胞質定位，因此本文聚焦于胞質中基因的翻譯調控。Puf蛋白調節(jié)mRNA的機制對于理解其功能至關重要。mRNA 5端帽和3端多聚腺苷尾巴對mRNA的翻譯起著重要的調控作用，它們分別與eIF4E和poly(A)結合蛋白(PABP)結合，5＇端帽和3＇端多聚腺苷尾巴也可阻止mRNA的降解，將其去除后會引發(fā)mRNA降解。

3.1 靶向翻譯抑制

翻譯起始是基因翻譯中的限速步驟。翻譯起始的阻斷主要通過真核起始因子(eIFs)磷酸化修飾。基因的翻譯機制在瘧原蟲和弓形蟲之間是高度保守的，eIF2α、eIF2β和eIF2γ共同形成eIF2復合物。eIF2能夠結合GTP，隨后與甲硫氨酸t(yī)RNA相互作用形成43S啟動復合物，當43S啟動復合物結合起始密碼子后，eIF2結合的GTP被水解，然后eIF2B催化GDP轉換為GTP，而eIF2α磷酸化阻止GDP轉換為GTP。因此，eIF2α磷酸化可以阻止翻譯起始。

Puf蛋白可以調節(jié)eIF2α特異性磷酸酶的表達。僅當瘧原蟲eIF2α去磷酸化時，瘧原蟲子孢子的潛伏期才被破壞進而進入肝內期。瘧原蟲eIF2α特異性磷酸酶尚未被鑒定，但磷酸酶抑制劑處理瘧原蟲子孢子增強了其eIF2α的磷酸化，這意味著瘧原蟲子孢子中可能存在eIF2α特異性磷酸酶。進一步研究證實瘧原蟲確實存在eIF2α特異性磷酸酶UIS2，Puf2缺失導致子孢子UIS2 mRNA水平升高。這些數(shù)據(jù)表明Puf2抑制瘧原蟲子孢子中eIF2α特異性磷酸酶表達[17]。同時Puf2的敲除導致瘧原蟲子孢子中的eIF2α特異性磷酸酶活性過早活化，導致其過早轉化為肝內期裂殖子。綜上所述，Puf2可以抑制瘧原蟲子孢子中eIF2α特異性磷酸酶的表達。

Puf蛋白可以與eIF4E競爭結合mRNA 5端帽結構。eIF4E與mRNA 5＇端帽結合對于翻譯起始也是必需的。因為翻譯起始需要mRNA環(huán)化，而eIF4G與eIF4E和Poly(A)結合蛋白(PABP)結合能夠促進了mRNA的環(huán)化。研究發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾Pum2與eIF4E競爭結合到mRNA 5＇端帽，這樣Pum2就可通過阻止起始復合物的組裝來抑制翻譯，但是原蟲是否存在此機制尚未見報道。

Puf蛋白調控PABP與eIF4G的相互作用。PABP在翻譯調控中發(fā)揮著多種作用，從保護mRNA 5端帽到與CNOT復合物相互作用來調控mRNA的翻譯。eIF4G和eIF4A通過eIF4E與5端帽結合，eIF4G可以結合PABP進而導致mRNA發(fā)生環(huán)化進而啟動翻譯[18]。酵母Puf5p和秀麗隱桿線蟲FBF-2可以干擾Pab1p-eIF4G的相互作用進而抑制靶mRNA翻譯。盡管在瘧原蟲子孢子的應激顆粒中發(fā)現(xiàn)了Puf2和PABP，但尚不清楚瘧原蟲Puf蛋白是否干擾eIF4G與PABP相互作用。

Puf蛋白與其他蛋白質或microRNA的相互作用。果蠅胚胎Nos促進Pum與靶mRNA的結合。與Pum2或Nos3的單一作用相比，Pum2和Nos3共同作用對SIAH1的抑制更明顯，這表明Nos3可以加強Pum2對靶mRNA的抑制作用[19]。惡性瘧原蟲7-Helix-1與已知的翻譯阻遏物(例如DOZI，CITH和Puf2)互作[20]，但是它們的功能是否疊加尚不清楚。TgAlba1和TgAlba1是RNA結合蛋白，TgAlba2的翻譯需要TgAlba1的表達。人源Pum1對p27的抑制作用是通過miRNA-miR-221和miR-222來實現(xiàn)的。

Puf蛋白可以調節(jié)靶mRNA的定位。酵母Puf6可以調節(jié)ASH1 mRNA的定位進而調控翻譯。Puf3可協(xié)助靶mRNA定位于線粒體[21]。

3.2 靶向mRNA的降解

去腺苷酶可以降解mRNA的多聚腺苷尾，這通常是mRNA降解中的限速步驟。該過程涉及CNOT復合物的活性，CNOT復合物是高度保守的多亞基復合物，其可協(xié)助調控基因的表達。CNOT包含兩個進化上保守的去腺苷酶Ccr4，CAF1及支架蛋白Not1。CNOT去除多聚腺苷尾后，mRNA的環(huán)結構被破壞，導致去帽激活因子DHH1與Not1締合，進而招募DCP1-DCP2去帽復合物[22]。

mRNA去腺苷化后進行脫帽和降解。酵母Puf5p可以結合Pop2p，隨后將Ccr4p募集到目標mRNA并對其去腺苷化。線蟲和人的Pum也和Pop2p相互作用，釀酒酵母Puf3可以通過募集CNOT和DHH1p來激活靶mRNA的去腺苷化[23]，推測Puf與CCR4-NOT復合物互作是一種保守的機制。但在原蟲中未發(fā)現(xiàn)此種機制，有待于進一步研究。

總之，Puf可以通過多種機制來影響目標轉錄本的穩(wěn)定性，例如，①通過抑制翻譯起始復合物的形成，與其他蛋白質和microRNA的相互作用以及靶向mRNA的定位來抑制翻譯。②通過與CCR4-NOT去腺苷酶復合物的相互作用進行去腺苷化進而引起的靶mRNA降解，Puf還可以增加靶標mRNA的穩(wěn)定性并增強翻譯，其機制需要進一步闡明。

4 Puf蛋白活性的調控

Puf活性可以被胞質非編碼RNA(ncRNA NORAD)調節(jié)，NORAD轉錄本富含Puf結合基序并被認為是Puf競爭性結合抑制劑。缺乏NORAD轉錄本，Puf在有絲分裂和線粒體功能中的活性將增強[24]。同時Puf蛋白也可以抑制NORAD的表達，這表明Puf-NORAD存在反饋回路[25]。

Puf蛋白還能夠結合靶mRNA基序之外的序列。Puf結合靶mRNA的“UGU”核心基序進而對其進行調控。但是核心基序外部序列的變化也可能導致Puf對靶mRNA的差異調節(jié)。人源Pum1的目標識別序列與Pum2的不同，這可能是由于核心基序外部序列不同所致[26]。

在轉錄和翻譯后水平上調節(jié)Puf蛋白。肌肉細胞增強因子2已被證明在果蠅中調節(jié)Pum啟動子活性，還發(fā)現(xiàn)Mef2誘導miR-134的表達進而下調Pum 2，藥物也可以調控果蠅Pum啟動子的活性[27]。果蠅Pum還受一類保守的RNA結合蛋白Fox(Rbfox1)的調控。Rbfox1的缺失會導致Pum mRNA和蛋白質水平增加。

翻譯后修飾來調節(jié)Puf蛋白的活性。當葡萄糖缺失時，酵母Puf3發(fā)生的磷酸化，而Puf3的磷酸化可將靶mRNA的命運從降解轉化為翻譯激活[28]。由此可見，轉錄因子、非編碼RNA、RBP和磷酸化修飾參與Puf蛋白活性的調控。

5 展望

雖然基因的轉錄后調控是消耗能量的，但其可以快速地對外界壓力做出反應來緩解壓力。當然蛋白修飾對刺激能做出更快的反應，但是其消耗能量更多及過早表達某些蛋白會阻止某些原蟲的階段轉化。Puf蛋白家族是真核生物中重要的基因轉錄后調控因子，其可以參與調控不同的生物學過程，同時Puf的表達也受許多信號的調節(jié)。論文重點概述了人和原蟲中經(jīng)典Puf蛋白的定位、生物學功能以及作用機制，希望能夠為原蟲Puf蛋白的研究提供可借鑒的資料，以期為原蟲新藥或疫苗的開發(fā)提供新思路。