豬δ冠狀病毒致病機(jī)制研究進(jìn)展

江 珊，李秀麗，張 莉，王利麗，李富強(qiáng)，路 超，鄭 麗，鄢明華*

(1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)天津科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，天津 300381)

豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一種豬腸道致病性冠狀病毒，該病毒可感染不同年齡段的豬群，仔豬感染PDCoV后主要出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、脫水和死亡等臨床癥狀[1]。該病毒自2012年發(fā)現(xiàn)于中國香港，現(xiàn)已在美國、加拿大、韓國、中國、泰國、老撾、越南等多個(gè)國家廣泛流行，在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。PDCoV是尼多目、冠狀病毒科、冠狀病毒亞科δ冠狀病毒屬的成員，是一種有囊膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約25.4 kb，可編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白、3種輔助蛋白和15種非結(jié)構(gòu)蛋白[4-5]。

PDCoV通過糞便-口腔途徑傳播，并在小腸絨毛上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制[6-7]。受感染的小腸絨毛上皮剝脫，隨后出現(xiàn)絨毛萎縮[6-7]。小腸細(xì)胞的大量丟失阻礙了小腸內(nèi)營養(yǎng)物和電解質(zhì)的吸收和消化，從而導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)吸收不良和消化不良性腹瀉以及由此引發(fā)的致命脫水[7]。目前，PDCoV的致病機(jī)制尚不清楚，尚無有效防治該病毒的疫苗和藥物。本文從PDCoV入侵細(xì)胞、逃逸宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，以及影響該病毒復(fù)制的其他分子機(jī)制等方面，就PDCoV致病相關(guān)的主要分子機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為今后深入認(rèn)識(shí)PDCoV致病機(jī)制及研制有效防治該病毒的疫苗和藥物提供參考。

1 PDCoV入侵細(xì)胞的分子機(jī)制

PDCoV能夠通過兩種蛋白酶入侵宿主細(xì)胞，一種是細(xì)胞表面的胰蛋白酶，另一種是內(nèi)吞體中的組織蛋白酶L(cathepsin L,CTSL)和組織蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)[2]。使用內(nèi)吞體酸化抑制劑巴非霉素-A1(bafilomycin-A1，Baf-A1)處理細(xì)胞可完全抑制PDCoV的入侵，而抑制CTSL或CTSB的表達(dá)則可顯著減少PDCoV的感染，這表明PDCoV能夠通過內(nèi)吞的方式入侵細(xì)胞。用胰蛋白酶處理細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)S蛋白的裂解與活化，從而使PDCoV從細(xì)胞表面直接入侵宿主細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜和病毒囊膜中存在的膽固醇對(duì)PDCoV病毒的入胞有關(guān)鍵作用，有助于PDCoV的復(fù)制[8]。用甲基-β-環(huán)糊精降低來源于細(xì)胞或病毒的膽固醇含量，可減少PDCoV對(duì)細(xì)胞的感染。而對(duì)已經(jīng)甲基-β-環(huán)糊精處理的細(xì)胞或病毒，添加外源性膽固醇可適度恢復(fù)PDCoV的感染性。

近年來，不同研究團(tuán)隊(duì)對(duì)豬氨基肽酶N(porcine aminoptidase N，pAPN)是否為PDCoV入侵宿主細(xì)胞的功能性受體進(jìn)行了研究，但結(jié)果并不全部一致。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)pAPN不能使PDCoV在其非易感細(xì)胞幼倉鼠腎細(xì)胞BHK-21上增殖，pAPN不是PDCoV入侵宿主細(xì)胞的受體[9]。PDCoV的S1蛋白與pAPN之間存在相互作用，并證明pAPN能夠介導(dǎo)PDCoV與宿主細(xì)胞表面結(jié)合，感染宿主細(xì)胞[10-11]。過表達(dá)pAPN可以使PDCoV感染非易感的BHK-21細(xì)胞，然而，特異性抑制pAPN表達(dá)并不能完全阻斷PDCoV感染豬回腸上皮細(xì)胞IPI-2I[12]。該研究表明pAPN雖然是PDCoV入侵細(xì)胞的功能性受體，但可能不是關(guān)鍵的功能性受體。PDCoVS1蛋白與pAPN存在相互作用，敲除pAPN可顯著降低PDCoV對(duì)細(xì)胞的感染，在過表達(dá)pAPN后可挽救這一抑制作用，再次證明了pAPN是PDCoV入侵細(xì)胞的功能性受體[13]。

2 PDCoV逃逸宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答

天然免疫應(yīng)答是宿主細(xì)胞抵御外源微生物(如病毒、寄生蟲和細(xì)菌)的第一道防線。病毒感染細(xì)胞后，其病原相關(guān)分子模式首先被來自細(xì)胞的模式識(shí)別受體識(shí)別，后者通過調(diào)節(jié)下游多種級(jí)聯(lián)信號(hào)，誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵產(chǎn)物Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)的產(chǎn)生。Ⅰ型IFN進(jìn)而與細(xì)胞膜上的干擾素受體結(jié)合，激活裂解酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Jak-STAT)通路，促進(jìn)下游干擾素刺激基因的表達(dá)，從而發(fā)揮天然免疫作用，抑制病毒的增殖。為了成功在細(xì)胞中增殖，病毒進(jìn)化出多種策略拮抗Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，從而逃逸宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答。

PDCoV感染豬腎小管上皮細(xì)胞LLC-PK1后，能夠通過靶向干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)阻斷維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ信號(hào)通路，干擾仙臺(tái)病毒或雙鏈RNA的合成類似物聚肌苷酸介導(dǎo)的 IFN-β啟動(dòng)子的激活，顯著抑制IFN-β的產(chǎn)生[14]。PDCoV能通過阻斷IRF3和p65的磷酸化與核轉(zhuǎn)位來抑制仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的IRF3和NF-κB的啟動(dòng)子活性，從而抑制了對(duì)IFN-β啟動(dòng)子的激活作用[14],該研究首次提出了PDCoV的天然免疫逃逸策略。PDCoV基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白、輔助蛋白及結(jié)構(gòu)蛋白均在其天然免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用。PDCoV非結(jié)構(gòu)蛋白5(nonstructure protein 5，NSP5)是Ⅰ型IFN的頡頏劑，可削弱NF-κB必須因子蛋白的表達(dá)，阻礙Ⅰ型IFN的生成[15]。在Ⅰ型IFN下游，NSP5也能通過裂解Jak-STAT信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白STAT2，抑制干擾素刺激基因的表達(dá)，從而抑制天然免疫應(yīng)答[16]。NSP5還可通過其蛋白酶活性，直接裂解Ⅰ型IFN下游的干擾素刺激基因豬mRNA-脫帽酶1A(porcine mRNA-decapping enzyme 1a，pDCP1A)，以減弱pDCP1A的抗病毒活性[17]。作為PDCoV輔助蛋白的NS6可以與RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation gene 5，MDA5)發(fā)生互作，這種互作能夠干擾RIG-Ⅰ/MDA5與雙鏈RNA的結(jié)合，抑制IFN-β的產(chǎn)生[18]。PDCoV的結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白可以通過干預(yù)雙鏈RNA及蛋白激酶R活化蛋白(protein kinase R (PKR)-activating protein，PACT)與RIG-Ⅰ的結(jié)合，以及抑制RIG-Ⅰ的K63多聚泛素化，頡頏IFN-β的產(chǎn)生[19-20]。

3 PDCoV誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞發(fā)生的受自身基因調(diào)控的自殺行為，病毒感染等多種應(yīng)激條件下均可發(fā)生，對(duì)抵抗病毒感染起著至關(guān)重要的作用。病毒感染宿主細(xì)胞是一種相互作用的過程，細(xì)胞可以通過凋亡過程清除病毒，抵抗病毒感染；病毒能夠延長細(xì)胞的存活時(shí)間，以最大限度地提高子代病毒的產(chǎn)量，或者通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)子代病毒的釋放和傳播，從而進(jìn)一步侵襲鄰近的細(xì)胞。

PDCoV在體內(nèi)不能誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡，但可誘導(dǎo)受PDCoV感染的豬腎細(xì)胞LLC-PK細(xì)胞和豬睪丸細(xì)胞ST細(xì)胞凋亡[21]。在感染PDCoV的仔豬腸絨毛上皮細(xì)胞中出現(xiàn)的空泡變性和壞死不是細(xì)胞凋亡引起的，可能是由于病毒的細(xì)胞溶解作用而導(dǎo)致的細(xì)胞壞死。PDCoV可通過激活細(xì)胞色素C介導(dǎo)的線粒體內(nèi)源性途徑，誘導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依賴性細(xì)胞凋亡[22]。PDCoV感染ST細(xì)胞后，通過募集Bax基因或線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放刺激線粒體外膜通透性，使凋亡線粒體細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活Caspase依賴的內(nèi)源性凋亡途徑，促進(jìn)病毒體外復(fù)制。另有研究表明，在PDCoV感染的ST細(xì)胞中，caspase 3、caspase 8和caspase 9的活性隨病毒感染量的增多而顯著提高，表明PDCoV感染可同時(shí)激活內(nèi)源性與外源性ST細(xì)胞凋亡通路[23]。氯化鋰和甘草酸二銨可以抑制PDCoV感染引起的LLC-PK1細(xì)胞凋亡，但二種藥物是否通過抑制細(xì)胞色素C介導(dǎo)的線粒體內(nèi)源性途徑抑制PDCoV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有待進(jìn)一步研究[24]。

PDCoV并非可誘導(dǎo)所有宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡。使用PDCoV感染豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，經(jīng)免疫熒光和TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，多數(shù)PDCoV抗原陽性的IPEC-J2細(xì)胞未出現(xiàn)TUNEL陽性信號(hào)，表明PDCoV體外感染IPEC-J2細(xì)胞可能不誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而是導(dǎo)致細(xì)胞壞死[25]。

4 影響PDCoV復(fù)制的其他分子機(jī)制

病毒的基因組大小及編碼能力有限，為了實(shí)現(xiàn)大量增殖，會(huì)借助大量細(xì)胞因子或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路來完成自身復(fù)制。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路是控制大量細(xì)胞過程的中樞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶是MAPK信號(hào)通路的一種，由Raf、MEK1/2和ERK1/2這3個(gè)連續(xù)作用的激酶組成。在細(xì)胞外刺激下，這一信號(hào)通路導(dǎo)致許多ERK1/2下游底物磷酸化，使細(xì)胞增殖、分化或凋亡。多種病毒利用這一信號(hào)通路，在宿主細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制。PDCoV在感染細(xì)胞早期誘導(dǎo)ERK1/2的激活，ERK1/2的激活是PDCoV在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生子代病毒的必要條件[26]。抑制PDCoV誘導(dǎo)的ERK的激活，會(huì)影響PDCoV吸附細(xì)胞后病毒的生物合成與釋放。

鈣離子(Ca2+)是一種多功能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞。鈣離子參與調(diào)節(jié)心臟收縮、受精、胚胎成熟、細(xì)胞能量代謝、增殖和凋亡等多種過程，在細(xì)胞生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。鈣離子在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中維持著一定的濃度梯度，這種濃度梯度會(huì)受到通道、運(yùn)輸器和泵的調(diào)節(jié)，以適應(yīng)細(xì)胞的需要。PDCoV感染IPI-2I細(xì)胞后，可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[27]。EGTA螯合細(xì)胞外鈣離子能夠抑制PDCoV的復(fù)制，且這種抑制作用可通過補(bǔ)充鈣離子來彌補(bǔ)。L型鈣離子通道阻滯劑鹽酸地爾硫卓能夠通過抑制PDCoV復(fù)制周期中復(fù)制步驟，顯著減少PDCoV的感染。此外，L型鈣離子電壓門控通道亞單位CACNA1S的敲除也可抑制PDCoV的復(fù)制,表明PDCoV能夠通過調(diào)控鈣離子內(nèi)流促進(jìn)自身復(fù)制。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種能夠有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的技術(shù)，這種沉默或抑制作用是通過雙鏈RNA選擇性地抑制目標(biāo)基因mRNA的活性來實(shí)現(xiàn)的。RNAi可以通過短發(fā)卡RNA(short hairpin RNAs，shRNAs)或小干擾RNA干擾病毒復(fù)制，且與siRNA相比，shRNA的抑制作用更穩(wěn)定、更持久、更有效。有研究構(gòu)建了以PDCoVM和N基因?yàn)榘悬c(diǎn)的2個(gè)短發(fā)卡RNA表達(dá)質(zhì)粒pGenesil-M和pGenesil-N，將2種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后感染PDCoV病毒，從細(xì)胞病變、病毒滴度和PDCoV RNA水平等角度對(duì)兩種質(zhì)粒對(duì)PDCoV復(fù)制的抑制作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)[1]。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pGenesil-M或pGenesil-N的ST細(xì)胞中，PDCoV所致的細(xì)胞病變程度較輕，PDCoV的滴度和PDCoVRNA水平顯著降低。該研究首次報(bào)道了以PDCoV的M和N基因?yàn)榘悬c(diǎn)的shRNAs在體外發(fā)揮抗PDCoV作用，表明RNAi可以有效抗PDCoV感染。

氯化鋰和甘草酸二銨是2種廣譜抗病毒藥物，研究發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)LLC-PK1細(xì)胞PDCoV的復(fù)制均具有抑制作用，且該抑制作用呈劑量依賴性[24]。甘草酸二銨可以抑制PDCoV在細(xì)胞表面的附著，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。從抗病毒效果來看，氯化鋰的抗病毒活性優(yōu)于甘草酸二銨，且甘草酸二銨的毒性小于氯化鋰。兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)LLC-PK1細(xì)胞中PDCoV復(fù)制的抑制不具有協(xié)同作用。雖然研究表明氯化鋰和甘草酸二銨有潛力成為抗PDCoV的藥物，但目前兩種藥物在體外對(duì)PDCoV復(fù)制抑制作用的分子機(jī)制及體內(nèi)是否對(duì)PDCoV有抑制作用尚不清楚。

5 展望

PDCoV是豬重要的病毒性病原，現(xiàn)已成為引發(fā)我國豬腹瀉性疾病的主要病原之一。病毒的致病機(jī)制是研發(fā)有效疫苗和防治藥物的重要依據(jù)，因此，開展對(duì)于PDCoV引發(fā)疾病的防控相關(guān)研究具有重要意義。與豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒病毒等病原相比，關(guān)于PDCoV致病機(jī)制的研究相對(duì)較少，PDCoV入侵細(xì)胞的途徑、通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及逃逸天然免疫應(yīng)答促進(jìn)自身復(fù)制等更多的PDCoV致病相關(guān)分子機(jī)制有待進(jìn)一步探索。此外，盡管一些PDCoV編碼蛋白在其復(fù)制中的作用已經(jīng)明確，但對(duì)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)尚不清楚，其功能也需進(jìn)一步研究。目前對(duì)PDCoV編碼蛋白功能的研究集中于PDCoV逃逸宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答分子機(jī)制，但這些編碼蛋白是否通過其他分子機(jī)制參與PDCoV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，目前尚不清楚。MicroRNA(miRNA)是一類參與基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼RNA，在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究者已對(duì)影響其他引起豬腹瀉的冠狀病毒(如豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒)復(fù)制的miRNA及分子機(jī)制進(jìn)行探索，未來，miRNA也有望成為抗PDCoV感染新的研究熱點(diǎn)。

新型冠狀病毒肺炎簡(jiǎn)稱新冠肺炎，WHO于2020年2月11日正式命名為 2019 冠狀病毒病仍在全球的廣泛流行，使冠狀病毒再次成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，人們對(duì)冠狀病毒致病機(jī)制的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。未來，對(duì)不同冠狀病毒之間致病機(jī)制的共性與特性比較研究，也將對(duì)冠狀病毒的抗病毒藥物或疫苗的研制具有重要而深遠(yuǎn)的意義。